Demonstrerer en multiresistent<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Amplification Mikromatrise

Summary

En forsterkning microarray kombinerer asymmetrisk PCR forsterkning og microarray hybridisering til en enkelt kammer, som i betydelig grad strømlinjemicroarray arbeidsflyt for sluttbrukeren. Forenkling microarray arbeidsflyt er et nødvendig første skritt for å skape microarray-baserte diagnostikk som kan brukes rutinemessig i lavere ressursmiljøer.

Abstract

Forenkling microarray arbeidsflyt er et nødvendig første skritt for å skape MDR-TB microarray-baserte diagnostikk som kan brukes rutinemessig i lavere ressursmiljøer. En forsterkning microarray kombinerer asymmetrisk PCR forsterkning, target størrelse valg, target merking, og microarray hybridisering innen en enkelt løsning og inn i en enkelt microfluidic kammer. En gruppebehandling metoden er demonstrert med en 9-plex asymmetrisk mester mix og lav tetthet gel element microarray for genotyping multiresistent Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). Protokollen er beskrevet her kan være ferdig i 6 timer og gi korrekt genotyping med minst 1000 celle ekvivalenter av genomisk DNA. Innlemming on-chip vasketrinn er mulig, noe som vil føre til en helt lukket fragment fremgangsmåte og et system. Omfanget av multipleksing med en forsterkning microarray er slutt begrenset av antall primer parene som kan kombineres til en enkelt master mix og likevel oppnå ønsket følsomhet og spesifisitet resultattall, snarere enn antall sonder som er immobilisert i matrisen. På samme måte kan den totale analysetiden forkortes eller forlenges avhengig av den spesifikke tiltenkte bruk, problemstilling, og ønskede deteksjonsgrenser. Likevel, den generelle tilnærmingen betydelig strømlinjemicroarray arbeidsflyt for sluttbrukeren ved å redusere antall manuelt intensive og tidkrevende behandlingstrinn, og gir en forenklet biokjemisk og microfluidic banen for å oversette microarray-baserte diagnostikk i rutinemessig klinisk praksis.

Introduction

Tidlig tilfelle oppdagelse og rask behandling er ansett som de mest effektive kontrollstrategier for å redusere Mycobacterium tuberculosis (MTB) overføring ^ett, og det er nå bred enighet i TB fellesskap som et poeng av omsorg (POC) eller i nærheten av POC test for å samtidig diagnostisere tuberkulose og legemiddelresistens (DR) er nødvendig. Teknologier som Cepheid største GeneXpert og andre nukleinsyre-amplifikasjon tester redusere tiden til diagnose for mange TB-pasienter, og gir en hurtig avlesing som indikerer resistens overfor rifampicin eller utvalgte mutasjoner som gir resistens til andre første eller andre medikamenter ^2. Selv om sanntids-og isotermisk nukleinsyre-amplifikasjon testene er utformet for å identifisere medikament-resistente mutasjoner som fører til MDR-TB, er spekteret av mutasjoner de registrerer ofte utilstrekkelig til å utforme en individuell medikamentregime som svarer til den legemiddelresistens profilen av pasienten, og tekniske begrensninger knyttettil optisk cross-talk eller kompleksiteten av forsterkning og rapporterings kjemi ^{3 til 7 mai} begrense antall loci eller mutasjoner som blir funnet. Dermed er sporingsteknologien med høyere multipleksing kapasitet som kreves for å løse kjente hull i MDR-TB POC diagnostikk.

Mikromatriser og WHO-godkjent Hain linjen prØveassays kan adressere "multiple genet, flere mutasjoner" utfordring å diagnostisere MDR-TB ^8-29. Dessverre er disse hybridisering-basert, multipleksede deteksjons plattformer bruker multistep, komplisert, og open-fragment protokoller som krever betydelig opplæring og kompetanse i molekylære teknikker. Forsterkningen microarray ³⁰ er designet for å ta opp noen av disse microarray arbeidsflyt og operasjonelle hensyn. De forenkler fluidic prinsipper er å forsterke, hybridisere, og detektere nukleinsyre-mål innen en enkelt mikrofluidkammer. Brukeren introduserer nukleinsyre og forsterkning master blandes inn i et virvelkammer med en pipette og starter termisk sykling protokollen. For satsvis behandling metode som er vist her, er mikromatriser deretter vasket i bulkløsning, tørket og fotografert. Denne studien viser funksjonaliteten til en forsterkning microarray ved hjelp av en MDR-TB microarray test for rpoB (30 mutasjoner), katG (2 mutasjoner), Inha (4 mutasjoner), rpsL (2 mutasjoner), embB (en mutasjon), IS1245, IS6110 , og en intern forsterkning og hybridisering kontroll. Minst en matchende par av microarray prober (villtype (WT) og mutant enkelt-nukleotid (MU)) er inkludert for hver mutasjon av interesse. Rensede nukleinsyrer fra multi-legemiddelresistent M. tuberkulose er fra TDR Tuberkulose Strain Bank ^31. Gel element mikromatriser er fremstilt på glass-substrater ved kopolymerisasjon i det vesentlige som beskrevet andre steder ^32, bortsett fra at vi bruker 4% monomer og 0,05 mM av hver sonde i polymerisasjonskatalysatorenasjon blanding. Matriser er omgitt med en 50 ml pakning før bruk. Etter termisk sykling, hybridisering, og vasketrinn, er forsterkning mikromatriser avbildes på en Akonni bærbar analysator. Bakgrunn-korrigert, integrerte signalintensitet er hentet fra den rå. Tif bilder ved hjelp av en fast sirkel algoritme. Støy for hver gel element beregnes som tre ganger standardavviket for de lokale spot-bakgrunn. Genet mål er vanligvis betraktet påvisbare for signal til støy-forhold (SNR) verdier ≥ 3. For å bestemme nærvær eller fravær av en spesifikk mutasjon i hvert gen eller kodon, er en diskriminant forhold beregnet fra SNR verdiene som (WT-MU) / (WT + MU). Diskriminant forholdstall <0 er en indikasjon på en medikamentresistens-mutasjonen ved locus, mens forholdstall> 0 er beskrivende for villtype-sekvensen.

Protocol

For laboratorier som følger universelle forholdsregler PCR, er det operasjonelt mer effektivt å inkludere flere forsterkning mikromatriser og pakninger per substrat og vaske alle forsterkning mikromatriser samtidig i en bulk container, som beskrevet her. Forbruks formater er tilgjengelige for å utføre post-forsterkning microarray vasketrinn i en helt lukket, lukket fragment test, som rapportert andre steder 30,33. En. Setup Ekstraher og rense nukleinsyrer fra prøve…

Representative Results

Kvalitativ bildeanalyse kan gi innsikt i kilder til eksperimentell støy eller variasjon som er utfordrende å identifisere i datatabeller generert av automatisert bildeanalyse programvare. Dermed kan det være nyttig å visuelt konstatere at 1) alle gel elementer er intakt og uskadet, 2) den globale bakgrunnen er fri fra fluorescerende gjenstander som kan påvirke enkelte signal til støy-forhold () verdier SNR, 3) det er ingen bevis for bobledannelse eller ujevn forsterkning / hybridisering tvers over matrisen, og 4) …

Discussion

Omfanget av multipleksing med en forsterkning microarray har sin endelige diktert av effektiviteten av PCR multipleks asymmetrisk, ikke microarray. I vår erfaring, kan 10-12 unike primer parene lett multiplekset i en forsterkning microarray-format. Konvensjonelle primer og probe design kriterier gjelder derfor nye analyser, bortsett fra at man trenger også å vurdere mulige interaksjoner mellom løsningsorientert fase nukleinsyrer og immobilisert microarray sonder, den termiske effektiviteten av termisk cycler, og son…

Materials

MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips	Akonni Biosystems	Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus	Qiagen	#206143
Taq polymerase	Qiagen	#201207
RNAse-free water	Qiagen	#206143
Formamide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	#3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix	Akonni Biosystems	Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control	Akonni Biosystems	Inquire
20X SSPE	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#BP1328-4
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#BP151-500
Disinfecting Spray	Current Technologies, Inc.	#BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol	Decon Labs, Inc.	#8416
Equipment	Company	Catalog Number
Microarray imager, with automated image and data analysis software	Akonni Biosystems	100-20011
Thermal cycler with flat block insert	Akonni Biosystems	100-10021
High-throughput wash station and slide holder	ArrayIt	HTW
Dissecting forceps	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#10-300
Mini Vortexer	VWR	#3365040
Mini-centrifuge	VWR	#93000-196
Airbrush Compressor Kit	Central Pneumatic	#95630