증폭 마이크로 어레이 크게 최종 사용자를위한 마이크로 어레이 플로 간소화 단일 챔버로 비대칭 PCR 증폭 및 마이크로 어레이 혼성화를 결합한다. 마이크로 어레이 워크 플로우를 간소화하는 것은 정기적으로 낮은 자원 환경에서 사용할 수있는 마이크로 어레이 기반의 진단 프로그램을 만들기위한 필요한 첫 번째 단계입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
마이크로 어레이 워크 플로우를 간소화하는 것은 정기적으로 낮은 자원 환경에서 사용할 수있는 MDR-TB 마이크로 어레이 기반의 진단 프로그램을 만들기위한 필요한 첫 번째 단계입니다. 증폭 마이크로 어레이는 단일 솔루션 내의 단일 마이크로 유체 챔버로 비대칭 PCR 증폭, 타겟 사이즈 선택 대상 라벨링 및 마이크로 어레이 혼성화를 결합한다. 일괄 처리 방법은 다중 약물 내성 결핵균 (MDR-TB)을 유전형에 대한 9 복잡한 비대칭 마스터 믹스 저밀도 젤 요소 마이크로 어레이와 함께 보여줍니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 6 시간에 완성 된 게놈 DNA의 적어도 1,000 셀 당량의 정확한 유전자형을 제공 할 수 있습니다. 온칩 세척 단계 통합하면 완전히 폐쇄 된 앰플 리콘 방법 및 시스템에 발생되는, 가능하다. 증폭 마이크로 어레이와 다중화의 범위는 궁극적으로 단일 마스터 m으로 결합 할 수있는 프라이머 쌍의 개수에 의해 제한된다IX 여전히 오히려 어레이에 고정화되는 프로브의 개수보다 원하는 민감도 및 특이도 성능 메트릭을 달성한다. 마찬가지로, 총 분석 시간은 구체적인 용도, 연구 문제 및 소망의 검출 한계에 따라 짧게 또는 길게 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 일반적인 접근은 상당히 노동 집약적 및 시간 소모적 인 처리 단계의 수를 줄임으로써 최종 사용자에 대한 마이크로 어레이 플로를 간소화하고, 일상적인 임상 사례로 마이크로 어레이 기반 진단을 번역을 위해 단순화 된 생화학 적 및 미세 유동 경로를 제공한다.
서론
초기 증상 감지 및 신속한 치료가 결핵균 (MTB) 전송 1을 줄일 수있는 가장 효과적인 제어 전략으로 간주하고 치료 (POC) 또는 POC 시험 근처의 지점이 동시에 TB를 진단하는 TB 커뮤니티의 폭 넓은 합의가 지금이됩니다 및 약제 내성 (DR)가 필요합니다. 이러한 세 페이드의 GeneXpert 유용한 핵산 증폭 실험 같은 기술은 많은 TB 환자에 대한 진단 시간을 단축하고, 리팜핀 또는 다른 제 또는 제 2 라인 약물이 내성을 부여 선택된 돌연변이에 대한 내성을 나타내는 빠른 판독을 제공한다. 실시간 및 등온 핵산 증폭 검사가 MDR-TB 초래할 약물 내성 돌연변이를 식별하도록 설계되어 있지만, 그들이 검출 돌연변이 스펙트럼은, 환자의 약물 내성 프로파일에 대응하는 개별 약물 요법을 디자인하는 것이 부적절 및 관련 기술 제약광학적 크로스 토크 (cross-talk) 또는 증폭 및보고 케미스트리의 복잡성 3-7 유전자좌 또는 검출 된 돌연변이의 수를 제한 할 수있다. 따라서, 높은 다중 용량 감지 기술은 MDR-TB의 POC 진단에 알려진 격차를 해결하기 위해 필요합니다.
마이크로 어레이 및 WHO 승인 한 Hain의 라인 프로브 분석은 MDR-TB
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
보편적 인 PCR주의 사항을 준수 실험실의 경우, 여러 가지 증폭 마이크로 어레이 기판 당 가스켓을 포함하고 여기에 설명 된대로, 벌크 용기에 모두를 동시에 증폭 마이크로 어레이를 세척하는 운영 체제는 더 효율적입니다. 다른 30,33보고 소모품 형식은, 완전히 밀봉 폐쇄의 증폭 검사에서 사후 증폭 마이크로 어레이 세척 단계를 수행 할 수 있습니다.
1. 설치
- 추출하고 선택하는 방법과 적절한 바이오 안전성 조건에서 시료로부터 핵산을 정화. 요구 사항은 핵산 비대칭, 멀티 플렉스 PCR 증폭을위한 충분한 순도가 될 것입니다.
- 오염 제거 솔루션과 표면 및 장비를 닦아 작업 공간을 준비합니다.
- 얼음이나 차가운 블록을 증폭 시약을 놓습니다.
- 증폭 마스터 믹스에 대한 멸균 1.5 ML의 미세 원심 분리 튜브를 레이블 및 멸균 0.2 ML의 microfuge TU 레이블각 시료에 대한 수.
- 시약은 짧게 소용돌이를 해동 미니 원심 분리기 펄스 스핀 튜브의 바닥에 내용을 수집 한 후. DNA 형성 촉매 효소 와동하지 마십시오. 조심스럽게 혼합하고 미니 원심 분리기 펄스 스핀 따라 튜브를 가볍게.
- ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
정 성적 이미지 분석은 자동화 이미지 분석 소프트웨어에 의해 생성 된 데이터 테이블에서 식별되는 도전 실험 소음 또는 가변성의 소스에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 따라서, 1) 모든 젤 성분이 손상 및 손상되지, 2) 글로벌 배경 잡음 비율 (SNR) 값을 각각의 신호에 영향을 줄 수있는 형광 유물이없는 것을 확인 시각적으로 유용 할 수있다, 3)에 대한 증거는 없다 기포 형성 또는 불균일 증폭 / 혼성화 어레이에 걸쳐, 4) 소프트웨어가 정확하게 마이크로 어레이 이미지에서 모든 지점을 식별한다는. 예 MDR-TB 증폭 마이크로 어레이 이미지가 고품질 및 배열로 인해 열 사이클링 동안 물리적 손상이나 기포에 발생할 수있는 아티팩트를 나타내는,도 1에 나타낸다. 표준 마이크로 어레이 이미지 분석 소프트웨어는 일반적으로 격자를 배치하고 심지어 SH 불량한 품질의 이미지에서 적분 강도와 배경 데이터를 추출 할 수있다자신의 그림 1B에서, 수락 또는 추가 분석에서 마이크.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
증폭 마이크로 어레이와 다중화의 정도는 최종적으로 비대칭 멀티 플렉스 PCR의 효율 아니라 마이크로 어레이에 의해 결정된다. 우리의 경험에 의하면, 10-12 독특한 프라이머 쌍은 쉽게 증폭 마이크로 어레이 형식으로 다중화 될 수있다. 기존의 프라이머 및 프로브 설계 기준에 따라서 그 중 하나는 또한 솔루션 상 핵산과 고정 된 마이크로 어레이 프로브, PCR 버퍼에 열 열 자전거 타는 사람의 효율성 및 프로브 하이브리드 동작 사이의 잠재적 인 상호 작용을 고려할 필요를 제외하고, 새로운 분석에 적용되는도 PCR 프라이머 및 저 분자량 증폭 유물이 포함되어 있습니다. 이러한 전체 게놈 증폭으로 높은 멀티 플렉스 증폭 방법은 임의의 헥사과 고정 된 프로브 사이의 간섭, 긴, 이중 가닥 증폭 산물의 비효율적 인 하이브리드 등의 기술적 인 이유로, 다수의 단일 챔버 증폭 마이크로 어레이 프로토콜에 도움이되지 않습니다. 그곳에또한 개별 사용자가 사용자 정의 분석을 설계하거나 여기에 설명 된 MDR-TB 테스트를 사용할 때 고려해야 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 부여 RC3의 AI089106에서 건강 (NIH)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
MDR-TB 핵산은 열대 질병 (TDR), 제네바, 스위스에서 연구와 교육을위한 국제 연합 아동 기금 / 유엔 개발 계획 / 세계 은행 / 세계 보건기구 (WHO) 특별 프로그램에 의해 제공되었다.
우리는 프로토 타입 분석에 포함 할 수있는 특정 유전자 돌연변이에 대한 지침에 대한 미국 질병 통제 예방 센터의 박사 톰 Shinnick 감사합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| MDR-TB 증폭 마이크로어레이, 적용된 개스킷 및 사전 절단 커버 슬립 | 포함 Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR 키트, HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| 포름아미드 | 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific, Inc.) | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 비아세틸화 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X 농축 MDR-TB 프라이머 믹스 | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 증폭 및 억제 제어 | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| 트리톤 X-100 | 써모 피셔 사이언티픽, Inc. | #BP151-500 | |
| 소독 스프레이 | 커런트 테크놀로지스, Inc. | ||
| 70% 이소프로필 알코올 | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| 마이크로어레이 이미저, 자동 이미지 및 데이터 분석 소프트웨어 | 포함 Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| 플랫 블록 인서트가 있는 열 순환기 | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| 고처리량 세척 스테이션 및 슬라이드 홀더 | ArrayIt | HTW | |
| 해부 겸자 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| 미니 보텍서 | VWR | #3365040 | |
| 미니 원심분리기 | VWR | #93000-196 | |
| 에어브러시 압축기 키트 | 중앙 공압# | 95630 |
참고문헌
- Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40(2010).
- World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
