Isolement des ARNm associés aux mitochondries de levure pour étudier les mécanismes de traduction localisée
Summary
De nombreux ARNm codant pour des protéines mitochondriales sont associés à la membrane externe de la mitochondrie. Nous décrivons un procédé de fractionnement subcellulaire visant à l'isolement des mitochondries de levure avec ses ARNm et des ribosomes associés. Ce protocole peut être appliqué à des cellules cultivées dans des conditions diverses dans le but de révéler les mécanismes de localisation des ARNm et traduction localisée près des mitochondries.
Abstract
La plupart des protéines mitochondriales sont codées dans le noyau et doivent être importées dans l'organite. Importation peut se produire alors que la protéine est synthétisée à proximité des mitochondries. L'assistance pour cette possibilité est fondée sur des études récentes, dans lequel de nombreux ARNm codant pour des protéines mitochondriales ont été présentées à être localisées à proximité de mitochondries. Avec des manifestations antérieures de l'association des ribosomes à la membrane externe, ces résultats suggèrent un processus de traduction localisée. Cette traduction localisée peut améliorer l'efficacité de l'importation, fournir des sites de régulation uniques et réduire les cas de l'expression ectopique. Diverses méthodes ont été utilisées pour caractériser les facteurs et les éléments qui assurent la médiation de traduction localisée. Norme d'entre eux est un fractionnement sous-cellulaire par centrifugation différentielle. Ce protocole présente l'avantage d'isoler des ARNm, les ribosomes et les protéines en une seule procédure. Ceux-ci peuvent ensuite être caractérisés par divers moléculaire et biméthodes ochemical. En outre, la transcriptomique et la protéomique méthodes peuvent être appliquées à la matière résultante, permettre ainsi un aperçu de l'ensemble du génome. L'utilisation de la levure comme organisme modèle pour ces études a les avantages de rapidité, de simplicité et de coût. En outre, les outils de la génétique de pointe et des souches de suppression disponibles faciliter la vérification des facteurs de candidats.
Introduction
Les cellules eucaryotes sont organisés dans des compartiments distincts ayant des fonctions spécifiques. Pour remplir sa fonction, chaque compartiment contient un ensemble unique de protéines qui sont essentielles pour son activité. Un mécanisme possible par lequel ces protéines abordent leur compartiment est localisée par 1,2 de traduction. Dans ce procédé, la protéine est synthétisée à sa destination par les ribosomes et les ARNm qui y sont situés. Parmi les avantages probables de traduction localisée augmentent l'efficacité de la protéine de ciblage, de réduction du besoin de protéines chaperons, et permettant des mécanismes de régulation spécifiques au site. En outre, les ARNm et des ribosomes localisées peuvent être un réservoir isolé de machinerie de traduction en cas de stress cellulaire, lorsque la traduction générale est inhibée.
Mitochondries est devenu ces dernières années un modèle central à étudier traduction localisée. La plupart des protéines mitochondriales sont codées dans le noyau, traduites dans le cytosol,et importées dans l'organite. Divers éléments de preuve indiquent que bon nombre de ces protéines sont produites par un processus de traduction locale. Initialement, les études de microscopie électronique et de fractionnement biochimique détectés ribosomes associés aux mitochondries 5.3. Ces études ont été ensuite corroborées in vivo par le travail sur des ARNm spécifiques, qui ont été trouvés à être importés que d'une manière 6,7 cotraductionnelle. études de génome entier d'ARNm liaison avec les mitochondries ont montré qu'une fraction significative d'ARNm sont localisés au voisinage de la mitochondrie 8-10. Certains de ces ARNm ont été en outre caractérisé par fluorescence in vivo méthodes, comme le poisson ou MTAG 9,11. Une interprétation straight-forward de cette association est que ces ARNm servent de modèles pour la traduction localisée.
Les mécanismes par lesquels ces ARNm approchent les mitochondries ne sont pas connus. domaines non codantes (plus significantl3 'UTR y) ont été présentés à participer à l'ARNm association aux mitochondries 12. Ces domaines sont susceptibles de servir de site de liaison à des protéines liant l'ARN qui assurent la médiation de leur transport. Les études chez la levure ont révélé qu'un membre de la famille de PUM de protéines (Puf3) prend en charge l'association d'ARNm avec des mitochondries 8,13. Un rôle plausible pour Puf3, qui est basée sur les fonctions des autres membres de la famille, est d'inhiber la traduction de l'ARNm en est en route 14. Ainsi, les ARNm peuvent être transportés dans un état non traduite, par des protéines de liaison d'ARN qui interagissent avec les régions non codantes. En variante, un grand nombre de travaux suggèrent que le transport a lieu pendant que la protéine est synthétisée. En particulier, les inhibiteurs de la traduction ont été montrés pour affecter ARNm association 8,13. En outre, les caractéristiques traduits tels que l'AUG, la séquence de ciblage mitochondrial (MTS) ou les régions ORF sont présentés pour aider à la localisation 8,11,15. Hsp70-famille de protéines chaperone et récepteur de la protéine sur la membrane externe des mitochondries ont également été présentés à l'appui de liaison de l'ARNm, ce qui implique en outre que les caractéristiques-protéine codée sont importantes pour la localisation de l'ARNm 16. Ceci est en accord avec un modèle dans lequel la protéine de ribosome-émergentes sert d'élément de reconnaissance pour le ciblage complexe ribosome-ARNm-protéine à la mitochondrie 17.
Traduction localisée près de la mitochondrie a été étudié par diverses méthodes, y compris la microscopie électronique (pour visualiser les ribosomes) 3, FISH 9, ARN vert (pour détecter les ARNm spécifiques) 11, et le fractionnement biochimique (pour détecter l'ARN et des ribosomes) 10,18. Alors que les méthodes antérieures de détecter la localisation in vivo et peuvent permettre la visualisation de la dynamique de transport, celui-ci permet une détection de plusieurs ARNm différents dans une seule expérience. En outre, pour le codage de fractionnement biochimique ou non codantes domaines n'ont pas besoin d'être altation, par conséquent, leurs rôles spécifiques peut être évaluée. Fractionnement biochimique a été utilisée avec succès pendant de nombreuses années, pour l'isolement de nombreux compartiments cellulaires différents. Ses principes et les limites sont bien établies, et on peut facilement modifier les protocoles existants à des fins différentes. L'instrumentation nécessaire est la norme dans de nombreux laboratoires, il est donc généralement la première méthode de choix pour l'étude de la localisation intracellulaire. Nous décrivons un protocole qui a été optimisée pour l'isolement des ARNm tandis que les ribosomes sont associés aux mitochondries. Ce protocole est donc optimale pour étudier les facteurs impliqués dans la traduction localisée près de mitochondries.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les progrès technologiques en matière d'imagerie ont donné des outils de haute résolution pour étudier la localisation des ARNm. Aujourd'hui, on peut mesurer le mouvement même d'une molécule d'ARNm unique à l'échelle de temps ms 23-26. Pourtant, des approches biochimiques traditionnels, comme celui décrit ci-dessus, sont également informative et sont préférables dans certains cas. L'isolement biochimique permet la purification d'un large répertoire d'ARNm et de pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les Drs. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines et Doron Rapaport de l'aide et des commentaires lors de la mise en place de ce protocole. Ce travail est financé par l'ISF (numéro de subvention 1193-1109).
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
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