Isolierung von mRNAs Verbunden mit Hefe-Mitochondrien Study Mechanismen der lokalisierten Übersetzung
Summary
Viele mRNAs mitochondriale Proteine kodieren, sind mit der äußeren Mitochondrien-Membran verbunden. Wir beschreiben eine subzellulärer Fraktionierung Verfahren auf Isolierung von Hefe-Mitochondrien mit den zugehörigen mRNAs und Ribosomen ab. Dieses Protokoll kann auf Zellen unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, um die Mechanismen der mRNA-Lokalisierung und Übersetzung lokalisiert in der Nähe der Mitochondrien zeigen angewendet werden.
Abstract
Die meisten mitochondrialen Proteine sind im Zellkern codiert und müssen in der Organelle eingeführt werden. Import auftreten können, während das Protein in der Nähe der Mitochondrien synthetisiert. Unterstützung für diese Möglichkeit wird von neueren Untersuchungen, in denen viele mRNAs mitochondriale Proteine kodieren, wurden gezeigt, um in die Nähe Mitochondrien lokalisiert werden abgeleitet. Zusammen mit früheren Demonstrationen der Verein Ribosomen 'mit der äußeren Membran, legen diese Ergebnisse eine lokalisierte Übersetzungsprozess. Solche lokalisierten Übersetzung können Einfuhr Effizienz zu verbessern, bieten einzigartige Regelung Websites und Fälle von Eileiter Ausdruck zu minimieren. Wurden verschiedene Methoden verwendet, um die Faktoren und Elemente, die lokalisierte Übersetzung vermitteln zu charakterisieren. Norm unter diesen ist subzellulärer Fraktionierung durch differentielle Zentrifugation. Dieses Protokoll hat den Vorteil der Trennung von mRNAs, Ribosomen und Proteine in einem einzigen Verfahren. Diese können dann durch verschiedene molekulare und Bi charakterisiert werdenochemical Methoden. Darüber hinaus können Transkriptomik und Proteomik Methoden, um das entstehende Material aufgebracht werden, dadurch zu ermöglichen, genomweite Einsichten. Die Nutzung von Hefe als Modellorganismus für solche Studien hat die Vorteile von Geschwindigkeit, Kosten und Einfachheit. Darüber hinaus sind die fortschrittlichen Werkzeugen und genetische verfügbar Deletionsstämmen erleichtern die Überprüfung der Kandidaten Faktoren.
Introduction
Eukaryotische Zellen sind in verschiedene Abteile mit spezifischen Funktionen organisiert. Um ihre Funktion zu erfüllen, enthält jedes Kompartiment einen einzigartigen Satz von Proteinen, die für seine Aktivität sind. Ein möglicher Mechanismus, durch den diese Proteine ihre Raum zu nähern, ist durch lokalisierte Übersetzung 1,2. Bei diesem Verfahren wird das Protein an seinem Ziel durch Ribosomen und mRNAs, die dort angeordnet sind, synthetisiert. Unter den wahrscheinlichen Vorteile der lokalisierten Übersetzung erhöht Effizienz der Protein Targeting, verringert müssen für die Protein Chaperone und ermöglicht somit eine gezielte Regulationsmechanismen. Auch können lokalisierte mRNAs und Ribosomen eine abgelegene Reservoir der Translationsmaschinerie in Fällen von zellulären Stress, wenn allgemeine Übersetzung wird gesperrt sein.
Mitochondrien wurde in den letzten Jahren ein zentrales Modell, um lokalisierte Übersetzung zu studieren. Mitochondrien sind die meisten Proteine in den Zellkern, in das Cytosol übersetzt codiert,und in den Organellen importiert. Verschiedene Beweislinien zeigen an, dass viele dieser Proteine werden durch einen lokalen Übersetzungsverfahren hergestellt. Zunächst erfasst Elektronenmikroskopie und biochemische Fraktionierung Studien Ribosomen mit 3-5 Mitochondrien verbunden. Diese Studien, in denen dann in vivo durch die Arbeit an spezifischen mRNAs, die gefunden wurden, nur in einer Art und Weise cotranslationalen 6,7 importiert werden bestätigt. Genomweite Assoziationsstudien von mRNAs mit Mitochondrien zeigten, dass ein signifikanter Anteil der mRNAs zu den Mitochondrien lokalisiert Bereich 8-10. Einige dieser mRNAs wurden durch in vivo Fluoreszenzverfahren, wie z. B. Fisch oder MTag 9,11 gekennzeichnet. Eine geradlinige Auslegung des Vereins ist, dass diese mRNAs dienen als Vorlagen für die lokale Übersetzung.
Die Mechanismen, mit denen diese mRNAs nähern sich den Mitochondrien sind unbekannt. Nicht-kodierende Bereiche (die meisten significantly 3 'UTR) wurde gezeigt, dass in der mRNA-Assoziation zu den Mitochondrien 12 beteiligt werden. Diese Domains sind wahrscheinlich als eine Bindungsstelle an RNA-bindende Proteine, die ihre Transport vermitteln zu dienen. Studien in Hefe gezeigt, dass ein Mitglied der Familie von Proteinen PUM (Puf3) unterstützt mRNA Assoziation mit Mitochondrien 8,13. Eine plausible Rolle Puf3, die auf Funktionen der anderen Familienmitglieder basiert, ist die Translation hemmen, während die mRNA ist auf dem Weg 14. Somit kann in einer nicht-translatierte mRNAs Zustand transportiert werden, die durch RNA-bindende Proteine, die mit nicht-kodierenden Regionen interagieren. Alternativ kann eine große Menge an Arbeit schlägt vor, dass der Transport stattfindet, während das Protein synthetisiert wird. Insbesondere wurden Übersetzung Inhibitoren gezeigt mRNAs beeinflussen Verband 8,13. Darüber hinaus übersetzt Features wie die AUG mitochondriale Targeting-Sequenz (MTS) oder ORF Regionen wurde gezeigt, dass in der Lokalisierung 8,11,15 unterstützen. Hsp70-Proteinfamilie chaperone und Protein-Rezeptor auf der äußeren Mitochondrien-Membran wurde auch gezeigt, unterstützt mRNA Assoziation, ferner impliziert, dass codierte Protein-Funktionen sind wichtig für die mRNA-Lokalisierung 16. Dies steht im Einklang mit einem Modell, in dem die Schwellenribosomenprotein dient als Erkennungselement für das Targeting mRNA-Ribosom-Protein-Komplex zu den Mitochondrien 17.
Lokalisierten Übersetzungs nahe der Mitochondrien wurde durch verschiedene Verfahren, einschließlich Elektronenmikroskopie (Ribosomen sichtbar) 3, FISH 9, grün-RNA (mRNA spezifisch zu erkennen) 11, und biochemische Fraktionierung (sowohl RNA und Ribosomen erkennen) 10,18 sucht. Während die früheren Methoden erfassen Lokalisierung in vivo und können Visualisierung der Verkehrsdynamik zu ermöglichen, letzteres ermöglicht den Nachweis von verschiedenen mRNAs in einem einzigen Experiment. Außerdem für biochemische Fraktionierung Codierung oder nicht-kodierenden Bereiche brauchen nicht zu alNamen daher ihren jeweiligen Rollen ausgewertet werden. Biochemische Fraktionierung wurde erfolgreich seit vielen Jahren verwendet, für die Isolierung von verschiedenen zellulären Kompartimenten. Seine Prinzipien und Grenzen sind gut etabliert, und man kann den bestehenden Protokollen für verschiedene Zwecke leicht ändern. Die notwendige Instrumentierung ist in vielen Labors Standard, daher ist es in der Regel die erste Methode der Wahl für die Untersuchung intrazelluläre Lokalisation. Wir beschreiben ein Protokoll, das für die Isolierung von mRNAs optimiert wurde, während Ribosomen sind mit Mitochondrien assoziiert. Dieses Protokoll ist daher optimal für die Untersuchung Faktoren in der Nähe von Mitochondrien lokalisiert Übersetzung beteiligt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Technologische Fortschritte in der Bildgebung hatte hohe Auflösung Tools ergab mRNA-Lokalisierung zu studieren. Heute kann man die Bewegung auch nur eines einzigen mRNA-Molekül auf der ms-Zeitskala von 23 bis 26 zu messen. Doch herkömmliche biochemische Methoden, wie das oben beschrieben wurde, sind auch informative und sind in einigen Fällen bevorzugt. Biochemische Isolierung ermöglicht die Reinigung eines großen Repertoires von mRNAs und Proteine, und ist daher bevorzugt für die Genom-weite Studien. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Drs.. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines und Doron Rapaport für Hilfe und Kommentare bei der Gründung dieses Protokolls. Diese Arbeit wird von der ISF (Grant-Nummer 1193-1109) finanziert.
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
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