현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

요약

미토콘드리아 단백질을 코딩하는 대부분의 mRNA는 미토콘드리아 외부 막과 연결되어 있습니다. 우리는 관련의 mRNA와 리보솜과 효모 미토콘드리아의 고립을 목표로 세포 내 분획 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 mRNA의 지방화의 메커니즘과 미토콘드리아 근처 현지화 번역을 표시하기 위해 다양한 조건에서 자란 세포에 적용 할 수 있습니다.

초록

미토콘드리아 단백질의 대부분은 핵으로 인코딩 및 세포 기관으로 수입 할 필요가있다. 단백질이 미토콘드리아 근처에 합성하는 동안 수입이 발생할 수 있습니다. 이 가능성에 대한 지원은 미토콘드리아 단백질을 코딩하는 많은의 mRNA가 미토콘드리아 부근에 지역화하는 것으로 된 최근 연구에서 파생됩니다. 함께 외부 막과 리보솜 협회 이전 시위, 이러한 결과는 현​​지화 번역 과정을 제안한다. 현지화 번역, 수입 효율을 향상 독특한 규제 사이트를 제공하고 자궁외 표현의 경우를 최소화 할 수 있습니다. 다양한 방법이 지역화 된 번역을 중재 요인과 요소를 특성화하기 위해 사용되어왔다. 이 가운데 표준 차동 원심 분리하여 세포 내 분획이다. 이 프로토콜은 하나의 절차에서 mRNA가 리보솜 단백질의 분리의 장점이 있습니다. 이들은 다음 다양한 분자량 및 BI에 의해 특성화 될 수있다ochemical 방법. 또한, transcriptomics 및 프로테오믹스 방법하여 게놈 넓은 통찰력에게 수, 생성 된 물질에 적용 할 수 있습니다. 이러한 연구의 모델 생물로 효모의 활용 속도, 비용과 단순성의 이점이있다. 또한, 진보 된 유전 도구와 사용 가능한 삭제 균주 후보 요인의 검증을 용이하게한다.

서론

진핵 세포는 특정 기능을 가지는 별개의 구획으로 구성되어 있습니다. 그 기능을 수행하기 위해, 각 구획의 활동에 필수적인 단백질의 고유 한 집합이 포함되어 있습니다. 이 단백질은 자신의 구획에 접근 통해 가능한 메커니즘은 로컬 라이즈 ^{1,2입니다.} 이 과정에서, 단백질은 리보솜 군데 위치에서 mRNA를 대상으로 합성된다. 현지화 번역의 가능성 장점이 단백질의 타겟팅의 효율성을 증가하는 가운데, 단백질 보호자에 필요한 감소하고, 사이트 별 규제 메커니즘을 가능하게한다. 또한, 지역화의 mRNA와 리보솜은 일반 번역이 억제되어 세포 스트레스의 경우 번역 기계의 외딴 저장 될 수 있습니다.

미토콘드리아는 최근 몇 년 동안 현지화 번역을 연구 중심 모델이되었다. 대부분의 미토콘드리아 단백질은 세포질로 번역 핵, 인코딩 된와 세포 기관으로 수입. 증거의 다양한 라인이 단백질의 많은 지역의 번역 과정을 통해 생산되는 것을 나타냅니다. 처음에는 전자 현미경 및 생화학 적 분류 연구는 미토콘드리아 ^3-5과 관련된 변이를 발견했습니다. 다음 만 cotranslational 방식으로 ^6,7 가져온 것으로 나타났다 특정의 mRNA에 일에 의해 생체 내에서 뒷받침 이러한 연구. 미토콘드....

프로토콜

1. 미토콘드리아 정화

세포의 펠렛을 단다. 약 0.6 g을 100 ㎖의 세포에서 얻을 수있다.

1. 30에서 ₆₀₀ = 1.5 과다 복용 효모 세포의 100 ~ 150 ㎖의 성장 미토콘드리아에 대한 풍부하기 위해, 이러한 갈락토스 기반 성장 매체로서 nonfermentable 성장 배지에 C를 °.
2. 원심 분리기 세포 실온에서 5 분 3,000 XG에 상층 액을 버린다.
3. 다시 증류수와 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오. 상층 액을 버린다.
4. 세포의 0.5 g 당 1 ㎖ DTT 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 그것에 의해 가수 분해를 향상 세포벽 내 이황화 결합을 파괴하기 위해 환원제로 세포를 치료하는 데 중요하다.
5. 30에서 10 분 동안 세포를 배양한다 부드러운 흔들림와 C를 °. 한편, 세포 1g 당 6 밀리그램 zymolyase의 무게를 Zymolyase 버퍼에 일시 중지합니다.
6. 5 분 3,000 XG에 원심 분리기 세포T 실내 온도와 상층 액을 버린다.
7. 세포의 0.15 g 당 1 ㎖ Zymolyase 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 없는 소용돌이를 수행합니다.

결과

이 프로토콜은 세포질 구성 요소에서 미토콘드리아 함유 부분을 분리 할 수​​ 있습니다. 성공을 테스트하는 가장 좋은 방법은 다른 분리 단계에서 샘플을 분석 북부와 서부 분석 (그림 1) 수행하는 것입니다. 격리 품질에 대한 세 가지 매개 변수는이 분석에서 파생됩니다. 첫째, 샘플에서 RNA 나 단백질은 손상 여부 - 이러한 분석에서 뚜렷한 밴드로 감지됩니다. 분해 이벤트를 추가, 짧은 밴드 또는 얼룩의 모양을 유도 할 것이다. 둘째, 입력 (즉, 전체)로부터의 신호와 각 단계에서의 신호를 비교하는 제제 중에 손실에 관한 중요한 정보를 제공한다. 심한 손실은 전체 신호의 상대적인 양 사이의 상당한 차이로 관찰 될 것이다. 마지막으로, 가장 중요한 미토콘드리아와 세포질 성분들 사이의 분리의 품질이 결정될 수있다. 그대로 mitochondri의 분리는 미토콘드리아 분획이 아닌 세포질 분획 (그림 1A)에서 미토콘드리아 전사 증명서를위한 신호가 발생합니다. .......

토론

이미징 기술의 발전은 mRNA의 현지화를 연구하는 높은 해상도 도구를 산출했다. 오늘날, 하나는 msec의 시간 스케일 ^{23-26이라도} 단일의 mRNA 분자의 움직임을 측정 할 수있다. 그러나, 전통적인 생화학 적 접근법은, 상술 한대로, 또한 유익한 일부 경우에 바람직하다. 생화학 격리의 mRNA 및 단백질의 큰 레퍼토리의 정화를 허용하고, 게놈 넓은 연구에 대한 것이 바람직하다. 하나의 분리, 하나는 DNA 마이크로 어레이 또는 RNA-SEQ ^18,27 의해 하나, 수천 개의 유전자의 특성화를 허용하도록 충분한 mRNA 수준을 얻을 수있다. 이와 병행하여, 하나의 단백질을 분리 및 미토콘드리아 ²⁸ 프로테옴을 특성화 단백질체 분석을 수행 할 수있다. 생화학 fractionations은 ER ⁽²⁹⁾ 특히, 다른 세포 소기관 미토콘드리아로부터 분리하도록 구성 될 수있다. 이것은 세포의 몇 가지 유형에 유리할 수있다 높은 공간 중첩이 있었다ER 및 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
효모 추출물
BactoPeptone
Galactose			성장 배지
			미토콘드리아 농축을 위해 갈락토오스 기반 성장 배지 살균 1% 효모 추출물, 2% 박토펩톤, 2% 갈락토스
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4	와 같은 비fermentable 탄소원을 사용해야 합니다.
30mM Tris-HCl, pH 7.6
디티오트레이톨(DTT)
10mM DTT 완충액			0.1m TrisHCl pH 9.4, 10mM 디티오트레이톨(DTT). 매번 신선하게 만드십시오
1.2 M 소르비톨
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μ m 필터
자이몰랴제 완충액			1.2 M 소르비톨, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. 이 버퍼를 필터링합니다(0.2 μ m) 및 향후 사용을 위해 실온에 보관
Zymolyase 20T			20,000 U/g
회수 배지			갈락토오스 기반 성장 배지에 1 M 소르비톨
0.1 mg/ml 시클로헥시미드(CHX)
0.6 M 만니톨
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml 헤파린
1 mM 페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF)
만니톨 완충액			0.6 m 만니톨, 30 mM 트리스-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. 새로 추가: 0.5 mg/ml 헤파린, 0.1 mg/ml CHX 및 1mM (PMSF). 이 완충액을 여과하고 얼음처럼 차갑게 사용하십시오
8 M Guanidinium-HCl
100 % 및 70 % 에탄올 (EtOH)
3 M 아세테이트 나트륨, pH 5.2
10 M LiCl 원액
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
글리세롤
β-메르캅토에탄올
브로모페놀 블루
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% 글리세롤, 20% β-메르캅토에탄올 및 0.02% 브로모페놀 블루
Dounce 15 ml 용량의 균질화기 타이트한 유봉

갈락토오스 를 오토클레이브하지 마십시오 이 장착되어 있습니다.