Isolering av mRNA associerad med jäst Mitokondrier att studera mekanismer för lokal Översättning
Summary
Många mRNA som kodar mitokondriella proteiner är associerade med mitokondrierna yttre membran. Vi beskriver en subcellulär fraktioneförfarande som syftar till isolering av jäst mitokondrier med tillhörande mRNA och ribosomer. Detta protokoll kan tillämpas på celler som odlas under olika förhållanden för att avslöja mekanismer för mRNA-lokalisering och lokal översättning nära mitokondrierna.
Abstract
De flesta av mitokondriella proteiner kodas i kärnan och måste importeras till organell. Import kan inträffa när proteinet syntetiseras nära mitokondrierna. Stöd för denna möjlighet kommer från nya studier, där många mRNA som kodar mitokondriella proteiner som visats vara lokaliserad till mitokondrierna närhet. Tillsammans med tidigare demonstrationer av ribosomer associering till yttermembranet, dessa resultat tyder på en lokaliserad process översättning. Sådan lokal översättning kan förbättra import effektivitet, ger unika reglerplatser och minimera fall av ektopisk uttryck. Olika metoder har använts för att karaktärisera de faktorer och faktorer som medierar lokaliserad översättning. Standard bland dessa är subcellulär fraktionering med differentiell centrifugering. Detta protokoll har fördelen att isolering av mRNA, ribosomer och proteiner i ett enda förfarande. Dessa kan sedan karakteriseras genom olika molekylära och biochemical metoder. Vidare kan transkriptomik och proteomik metoder appliceras på det resulterande materialet, och därigenom tillåta genomvida insikter. Användningen av jäst som modellorganism för sådana studier har fördelarna med hastighet, kostnader och enkelhet. Dessutom avancerade genetiska verktyg och tillgängliga stammar radering underlätta kontrollen av kandidatfaktorer.
Introduction
Eukaryota celler är organiserade i olika fack som har specifika funktioner. För att uppnå sin funktion, varje fack innehåller en unik uppsättning proteiner som är avgörande för dess verksamhet. En möjlig mekanism genom vilken dessa proteiner närmar sitt fack är av lokal översättnings 1,2. I denna process är det protein som syntetiseras vid slutpunkten med ribosomer och mRNA som finns där. Bland de sannolika fördelarna med lokaliserad översättning är ökad effektivitet av protein inriktning, minskat behov av protein följeslagare, och möjliggör platsspecifika regleringsmekanismer. Dessutom kan lokala mRNA och ribosomer vara en avskild reservoar av översättnings maskiner vid cellulär stress, då allmän översättning hämmas.
Mitokondrier blev under senare år en central modell för att studera lokaliserad översättning. De flesta mitokondrier proteiner kodas i kärnan, översatt i cytosolen,och importeras till organell. Olika bevislinjer tyder på att många av dessa proteiner produceras genom en lokal översättningsprocessen. Inledningsvis elektronmikroskopi och biokemisk fraktionestudier upptäcktes ribosomer förknippade med mitokondrier 3-5. Dessa studier var då som bekräftas in vivo genom arbetet med specifika mRNA, som befanns importeras endast på ett cotranslational sätt 6,7. Genome-omfattande studier av mRNA association med mitokondrier visade att en större del av mRNA är lokaliserade till mitokondrierna närhet 8-10. En del av dessa mRNA kännetecknas vidare av in vivo fluorescens metoder, såsom fisk eller mtag 9,11. En rättfram tolkning av denna förening är att dessa mRNA tjäna som mallar för lokal översättning.
De mekanismer genom vilka dessa mRNA närmar mitokondrierna är okända. Icke-kodande domäner (mest significantly 3 'UTR) visade sig vara inblandade i mRNA association till mitokondrierna 12. Dessa domäner är sannolikt att tjäna som ett bindningsställe för RNA-bindande proteiner som medierar deras transport. Studier i jäst visade att en medlem av PUM familj av proteiner (Puf3) stöder mRNA förening med mitokondrier 8,13. En trolig roll för Puf3, som är baserad på funktioner hos andra familjemedlemmar, är att hämma translation medan mRNA är på väg 14. Således kan mRNA transporteras i en icke-translaterad status, av RNA-bindande proteiner som växelverkar med icke-kodande regionerna. Alternativt föreslår en stor mängd arbete att transporter sker när proteinet syntetiseras. Framför allt var översättningshämmare visats påverka mRNA förening 8,13. Dessutom översatta funktioner som AUG, var mitokondriell målssekvens (MTS) eller ORF regioner visat att hjälpa till lokalisering 8,11,15. Hsp70-familjen protein chaperone och protein-receptor på mitokondrierna yttre membranet har också visat sig stödja mRNA association, vidare antyder att kodad protein funktioner är viktiga för mRNA-lokalisering 16. Detta överensstämmer med en modell där ribosomen-växande protein fungerar som igenkänningselement för att rikta mRNA-ribosom-proteinkomplexet till mitokondrierna 17.
Lokaliserad översättning nära mitokondrierna studerades genom olika metoder, inklusive elektronmikroskop (visualisera ribosomer) 3, FISH-9, grön-RNA (för att detektera specifika mRNA-sekvenser) 11, och biokemisk fraktionering (för att detektera både RNA och ribosomer) 10,18. Medan de tidigare metoderna upptäcker lokalisering in vivo och kan tillåta visualisering av transportdynamik, gör det senare upptäcka många olika mRNA i ett enda experiment. Dessutom, för biokemisk fraktione kodning eller icke-kodande domäner behöver inte vara alrade, därför kan utvärderas deras specifika roller. Biochemical fraktione har framgångsrikt använts under många år, för isolering av många olika cellulära avdelningar. Dess principer och begränsningar är väl etablerade, och man kan lätt ändra befintliga protokoll för olika ändamål. Den nödvändiga instrumenteringen är standard i många laboratorier, därför är det vanligtvis den första metoden för att studera intracellulära lokalisering. Vi beskriver ett protokoll som var optimerad för isolering av mRNA medan ribosomer är förknippade med mitokondrier. Detta protokoll är därför optimal för att studera faktorer som lokaliserad översättning nära mitokondrier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tekniska framsteg inom bildbehandling hade gett högupplösta verktyg för att studera mRNA lokalisering. Idag kan man mäta rörelsen av en enda mRNA-molekylen vid ms tidsskalan 23-26. Ändå traditionella biokemiska metoder, såsom den som beskrivits ovan, också är informativ och är att föredra i vissa fall. Biokemisk isolering möjliggör rening av en stor repertoar av mRNA och proteiner, och är därför att föredra för genomet hela studier. I en enda isolering kan man erhålla tillräckliga mRNA-ni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry tallar och Doron Rapaport för hjälp och synpunkter under upprättandet av detta protokoll. Detta arbete finansieras av ISF (licensnummer 1193-1109).
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3′-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., Bonifacino, J. S., et al. . Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
