Выделение и Культура Стоматологическая эпителиальных стволовых клеток из взрослых мышей резца

Summary

Постоянно растет резец мыши обеспечивает модель для изучения обновление тканей зуба из зубного эпителия стволовых клеток (десков). Надежная система для последовательно и надежно получения этих клеток из резца и расширение их в пробирке, как сообщается здесь.

Abstract

Понимание клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе регенерации зубов и продление стала тема представляет большой интерес ^1-4, а резец мыши обеспечивает модель для этих процессов. Этот замечательный орган постоянно растет в течение всей жизни животного и генерирует все необходимые типы клеток из активных пулов взрослых стволовых клеток, расположенных в его губной (к губе) и язычной (в сторону языка) шейки петли (CL) регионы. Только стоматологические стволовые клетки из губной CL привести к ameloblasts, которые генерируют эмаль, внешнее покрытие зубов, на губной поверхности. Это образование асимметричный эмаль позволяет истиранию на кончике резца, и клетки-предшественники и стволовые клетки в проксимальном резца гарантировать, что зубные ткани постоянно пополняется. Возможность изолировать и вырастить эти предшественники или стволовые клетки в пробирке позволяет их расширение и открывает двери для многочисленных экспериментов не достижимых в естественных условиях, например, чкайф пропускная тестирование регуляторных факторов потенциал стволовых клеток. Здесь мы описываем и продемонстрировать надежную и последовательный метод для культивирования клеток от губной CL резца мыши.

Introduction

Одной из уникальных характеристик позвоночных является эволюция зубов. Зуб стал важным модельной системой для многих областях исследований, как молекулярные пути и морфологические специализации, имеющих отношение к этому органу были исследованы с нескольких точек зрения, в том числе путем развития и эволюционных биологов ^5. Совсем недавно, в поле регенеративной медицины начал получить ценную информацию с помощью зуб в качестве модели. В частности, открытие стоматологических эпителиальных стволовых клеток была важным шагом вперед ^6-13.

Все грызуны обладают постоянно растущих резцов, чей рост подпитывается стволовых клеток, что делает эти зубы доступную модель системы для изучения регуляции взрослых стволовых клеток. Эксперименты маркировки в 1970-х годах ^10,11, а затем генетической линии розыска экспериментов ^8,9,12,14, показали, что десков проживают в проксимальной области резца. Стебельклеток потомство в эпителиальной отсек на губной стороны выйти из предполагаемого нише, известный как губной шейки петли (CL), и внести вклад в популяции клеток, называемых транзитных усиления (TA) клетки (рис. 1). В частности, десков проживают в наружной эмали эпителия (OEE) и звездчатого ретикулума (СР) ^8,9,14, а внутренний эмаль эпителий (НВО) приводит к клеткам TA, что прогресс через ограниченное число циклов клеток, а затем ход дистально по длине резца (рис. 1). , Отличительным ameloblasts в резца мыши продолжать двигаться дистально вдоль резца на замечательной скоростью около 350 мкм в один день ^15,16. Как они двигаются, клетки дифференцируются в зрелые ameloblasts и слой Intermedium (СИ) клеток. После нанесения полную толщину эмаль-матки, многие из ameloblasts апоптоз, а остальные клетки уменьшаться в размерах и регулируют созревание эмали <вир> 17. Родословная других типов клеток в губной CL, например, СР, менее ясно, и данные, касающиеся стволовых клеток в мезенхиме ¹⁸ и в языковой CL только начинают появляться.

Использование резцов модель мыши, ряд групп работали, чтобы выяснить генетические пути и биологические процессы клеток, участвующих в естественной основе клеток возобновления органов штока. Тем не менее, губной CL содержит относительно небольшое количество клеток, по оценкам, около 5000 за мыши резца, что делает работу с первичные элементы сложной. Таким образом, были предприняты усилия к культуре и расширить эти клетки в пробирке ^6,16,19,20, чтобы открыть новые двери для экспериментальных подходов, которые не достижимы в естественных условиях. Самое последнее исследование продемонстрировало, что эти клетки могут как самообновлению и дифференцировке в амелогенина экспрессирующих клеток при культивировании ^13. Здесь мы описываем и продемонстрировать способ-гоэ надежным и последовательным культура клеток из мыши губной CL.

Protocol

1. Препарировать Нижние Hemi-челюсти от взрослой мыши Перед выполнением этого протокола, получить необходимую институциональную одобрение и обязательно соблюдать все правила ухода за животными. Усыпить животное с использованием стандартных IACUC утвержденные процедуры. Для этой ра…

Representative Results

Мышь полуизотактическую челюсть состоит одна постоянно растет резца и три укоренившиеся моляров (рис. 1а). Все зубы состоят из дентина и эмали, двух минерализованных компонентов коронки зуба (фиг.1А и 1а '). Резца дома две стволовых клеток ниши называется губн…

Discussion

Эпителиальные клетки были впервые успешно культивируют более 40 лет назад ^21-24, а в последнее время, успешный изоляция эпителиальных стволовых клеток ^25-27 продвинулась наши знания о эпителиальной биологии. Мы сообщаем протокол для выделения десков резца взрослых мышей, относ?…

Materials

Forceps, size 5	Fine Science Tools	11251-30	FST by Dumont, Dumoxel,
Forceps Straight, fine, 3.5	Roboz	RS5070
Razorblades	Electron Microscopy Services	#71960
Scalpel Handle No.3	VWR
Feather Blade No. 15	Electron Microscopy Services	#72044-15	Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered	Worthington Biochemical Corporation	#4214
Insulin syringe	BD	#329424
Accumax	EMD Millipore	#SCR006
DMEM/F12	Gibco	11320-033
EGF	R&D	2028-EG-200
FGF2	R&D	233-FB-025
B27 Supplement	Gibco	10889-038