Imaging Dendritutskotten av Rat Primär hippocampus nervceller med hjälp av strukturerade Illumination Mikroskopi
Summary
Denna artikel beskriver ett arbetsprotokoll till bild Dendritutskotten från hippocampus nervceller in vitro med hjälp av strukturerade Illumination Mikroskopi (SIM). Super-upplösning mikroskopi använda SIM ger bildupplösning betydligt längre än ljuset diffraktionsgränsen i alla tre rumsliga dimensioner, vilket gör att avbilda enskilda Dendritutskotten med förbättrad detalj.
Abstract
Dendritutskotten är utskjutande delar som framkommit dendrit av en neuron och representerar de primära postsynaptiska mål för excitatoriska ingångar i hjärnan. Teknologiska framsteg har identifierat dessa strukturer som centrala delar i neuron-anslutning och synaptisk plasticitet. Den kvantitativa analysen av ryggraden morfologi med ljusmikroskop är fortfarande ett viktigt problem på grund av tekniska begränsningar i samband med ljusets inneboende brytningsgräns. Dendritutskotten kan lätt identifieras genom konfokala laserskanning fluorescensmikroskopi. Att mäta subtila förändringar i form och storlek på ryggarna är svårt eftersom andra än längden ryggrad dimensioner är oftast mindre än konventionell optisk upplösning som fastställs genom Ijusmikroskopi teoretiska upplösningsgräns av 200 nm.
Flera nyligen utvecklade superupplösning tekniker har använts för att bilden cellulära strukturer mindre än 200 nm, inklusive dendritiska ryggar. Tessa tekniker bygger på klassiska fjärrfältsoperationer och därmed tillåta användningen av befintliga provberedningsmetoder och bild bortom ytan av provexemplar. Beskrivs här är en arbetsprotokoll för att tillämpa superupplösning strukturerad belysning mikroskopi (SIM) för avbildning av Dendritutskotten i primära hippocampus neuron kulturer. Möjliga tillämpningar av SIM lappar med de av konfokalmikroskopi. De två teknikerna presentera olika tillämplighet. SIM erbjuder högre effektiv lateral upplösning, medan konfokalmikroskopi, på grund av användningen av en fysisk hål, uppnår upplösning förbättring på bekostnad av avlägsna ur fokus ljus. I detta protokoll primära neuroner odlas på täckglas av glas med användning av ett standardprotokoll, som transfekterats med DNA-plasmider som kodar för fluorescerande proteiner och avbildas med SIM. Hela protokollet beskrivet häri tar ungefär två veckor, eftersom Dendritutskotten avbildas efter 16-17 dagar in vitro, närdendritiska utveckling är optimal. Efter slutförandet av protokollet, kan Dendritutskotten rekonstrueras i 3D från serie SIM bildstaplar som använder specialiserad mjukvara.
Introduction
En dendritisk Ryggraden är ett litet utsprång av neuron-membran. Denna egenskap struktur är specialiserad på normalt ta emot synpunkter från en enda synaps och representerar den fysiska kontaktytan mellan två nervceller. De flesta funktionellt mogna Dendritutskotten bestå av en klotformig spets, benämnd huvud, och en tunn hals som ansluter huvudet till den dendritiska skaft. Men ryggar är inte statiska och aktivt flytta och ändra deras morfologi kontinuerligt även i den vuxna hjärnan 2. Inom en 2 veckors period, råtta primära hippocampus neuron kulturer som härrör från slutet av embryonal eller tidig postnatal tid utveckla komplexa dendritiska hållare med många membran utskjutande delar som utvecklas från tidig filipodia till rygg-liknande strukturer 3. Baserat på denna dynamiska beteende och andra egenskaper, är Dendritutskotten tänkt att ge en anatomisk substrat för minneslagring och synaptisk överföring 4,5.
Givet the avgörande roll att dendritiska ryggraden storlek och form har i synapserna, är det viktigt att mäta sina mått exakt. Ryggar variera från cirka 200 till 2000 nanometer i längd och kan lätt identifieras genom konfokala laseravsöknings fluorescensmikroskopi. Men andra än längd ryggrad dimensioner är oftast lägre än de konventionella optiska system "upplösning, teoretiskt fastställas genom diffraktion runt 200 nanometer 6. Dessa lösa befogenheter är otillräckliga för avbildning finare detaljer, som till exempel bredd ryggraden halsar och huvuden. Mycket arbete har ägnats åt att lösa detta problem och många relativt nya super-upplösning mikroskopitekniker har gett stora framsteg. I synnerhet är det möjligt att uppnå upplösning bortom den klassiska gränsen utan att kassera eventuella emissionsljus genom användning av lateralt strukturerad belysning mikroskopi (SIM) i ett brett fält, icke-konfokalt mikroskop 7-10. Med hjälp av denna teknik i kombination med icke-linear mikroskopitekniker, är det teoretiskt möjligt att förbättra den laterala upplösningen av den optiska mikroskop av ett obegränsat faktor 11. Men i de flesta experimentella förhållanden, gör SIM att överträffa upplösningen gränsen med en faktor två 1. Andra super-upplösning optisk mikroskopi tekniker såsom Stimulerad utarmning utsläpp (Sted) mikroskopi 12 och fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) 12 har använts för avbildning av Dendritutskotten. Lokaliseringsbaserade metoder såsom PALM kräver mycket stora mängder råbilder för att uppnå super-upplösning och är därför begränsade i hastighet. Å andra sidan, kan Sted uppnå hög utskriftshastighet, även vid relativt låga fotonräkning och små synfält, vilket inte kan vara fallet för SIM 13.
I denna artikel är syftet att ge en arbetsprotokoll till bild Dendritutskotten från råtta primära hippocampus nervceller odlade in vitro </em> med SIM. Protokollet består av två urskiljbara faser: en inledande en bestående etablering, utveckling, transfektion och immunohistokemi av råtta primära hippocampus neuron kulturer och en sen fas tillägnad prov avbildning.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här artikeln ett arbetsprotokoll till bild Dendritutskotten från råtta primära hippocampus nervceller odlade in vitro med hjälp av SIM beskrivs. Den primära hippocampala neuronkultur metod är en anpassning av den ursprungliga metod som beskrivits av Kaech och spikar 18. De viktigaste skillnaderna är att använda Neurobasal/B27 odlingsmedium, vilket eliminerar kravet på astroglial matar kulturer, och tillägget av mitosinhibitor FUDR på dag 3 som främjar neuronal överlevnad samtidigt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av ett VIDI licensnummer H64.09.016 från Nederländerna Organisationen för vetenskaplig forskning (NWO) till CPF. CPF är tacksam till Dr Silvina A. Fratantoni för hennes kritiska kommentarer och korrigeringar om det slutgiltiga manus. GMRDL / emmm stöds av det nederländska Technology Foundation STW (projekt 12151 och 11350), som är en del av NWO, och som delvis finansieras av ekonomiministeriet. Vi tackar Catherine Kitts och Peter Drent av Nikon Instrument Europe BV för hjälp och stöd. HX stöddes av Royal Dutch Academy of Arts and Sciences (bidrag 11CDP10) och WT stöddes av bidrag Nederländerna Organisationen för vetenskaplig forskning (anslag 820.02.006).
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
References
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
- Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 .
- Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).
- Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
- James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
- Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
- Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. , (2012).
- van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. , (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).
