वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एक चूहा syngeneic endothelial कोशिकाओं और astrocytes के सह संस्कृति से जुड़े एक में इन विट्रो बीबीबी मॉडल के reproducibility मान्य करने के लिए था. endothelial सेल monolayer उच्च तीर और कम भंडारण पारगम्यता प्रस्तुत किया. विशिष्ट टी जे प्रोटीन की अभिव्यक्ति, सूजन और ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स की कार्यक्षमता को कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया गया.
रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) विशेष रूप से रक्त और तंत्रिका ऊतक के बीच आणविक और सेलुलर प्रवाह को नियंत्रित करता है. हमारा उद्देश्य endothelial सेल monolayer भर transcytosis में शामिल रिसेप्टर्स अध्ययन करने के लिए प्राथमिक चूहे के मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (RBEC) के सह संस्कृतियों और astrocytes का उपयोग बीबीबी की इन विट्रो मॉडल में एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चूहा syngeneic के विकास और करने के लिए चिह्नित किया गया था. Astrocytes trypsin पाचन निम्नलिखित यांत्रिक विच्छेदन से अलग थे और बाद में सह संस्कृति के लिए जमे हुए थे. RBEC 5 सप्ताह पुराने चूहे cortices से अलग थे. दिमाग तानिका और सफेद बात के साफ, और यंत्रवत् enzymatic पाचन निम्नलिखित अलग थे. इसके बाद, ऊतक homogenate तंत्रिका ऊतक से पोत टुकड़े को अलग करने के गोजातीय सीरम albumin में centrifuged था. पोत टुकड़े उनके बाह्य मैट्रिक्स से मुक्त endothelial कोशिकाओं को एक दूसरे enzymatic पाचन कराना पड़ा. ऐसे pericytes के रूप में शेष contaminating कोशिकाओं च गयाurther puromycin युक्त मध्यम में microvessel टुकड़े चढ़ाना से सफाया कर दिया. वे तो कुओं के नीचे पर हो astrocytes के साथ सह संस्कृति के लिए फिल्टर पर passaged गया. RBEC तंग जंक्शन के उच्च स्तर व्यक्त ऐसी occludin के रूप में (टी जे) प्रोटीन, सेल सीमाओं पर एक ठेठ स्थानीयकरण साथ claudin -5 और ZO-1. TJS की तंगी का संकेत मस्तिष्क endothelial monolayers के transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीर), 300 ओम · औसतन 2 सेमी पहुंच गया. (ly) पीले लूसिफ़ेर के लिए endothelial पारगम्यता गुणांक (पे) / मिनट 0.26 ± 0.11 x 10 -3 सेमी की एक औसत के साथ अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य था. Monolayers में आयोजित मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं, तपका ट्रांसपोर्टर पी ग्लाइकोप्रोटीन (पी जीपी) व्यक्त rhodamine 123, पी जीपी के लिए एक ligand के एक polarized परिवहन दिखाया, और endothelial सेल monolayer भर transferrin-Cy3 और DiILDL की विशिष्ट परिवहन दिखाया. अंत में, हम एक में इन विट्रो की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदानकारण गुणवत्ता आश्वासन तरीकों को अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और कि बीबीबी ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स पर अनुसंधान के लिए उपयुक्त है कि बीबीबी मॉडल.
केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के इलाज के लिए विकसित कई दवाओं विकारों therapeutically प्रासंगिक सांद्रता में मस्तिष्क पैरेन्काइमा तक पहुँचने में असमर्थ हैं. बीबीबी रोगजनक एजेंटों से, प्लाज्मा रचना के उतार – चढ़ाव से मस्तिष्क तंत्रिका ऊतकों को बचाता है, और मस्तिष्क 1 में और बाहर आयनों, पेप्टाइड्स, प्रोटीन और यहां तक कि कोशिकाओं की गैर विशिष्ट प्रवाह को सीमित द्वारा मस्तिष्क पैरेन्काइमा के homeostasis बनाए रखता है.
बीबीबी विशेषताओं ऐसे न्यूरॉन्स के रूप में विशेष वर्ग मस्तिष्क microvessel endothelial कोशिकाओं और न्यूरो glia संवहनी इकाई के पड़ोसी तत्वों (NGVU) के बीच अंतरंग निकटता और परस्पर बात से प्रेरित और बनाए रखा है, glial कोशिकाओं (अधिक ठीक astrocyte अंत फुट), और pericytes कोलेजन प्रकार चतुर्थ, fibronectin, laminin और proteoglycans 2,3 की मुख्य रूप से होते हैं जो बेसल झिल्ली में ensheathed. केशिका स्तर पर endothelium के 32% और एक महत्वपूर्ण खेलने – pericytes लगभग 22 कवरअन्तःचूचुक प्रसार, angiogenesis और सूजन प्रक्रियाओं के नियमन में भूमिका. Endothelial कोशिकाओं केशिकाओं की भीतरी सतह को कवर करने के लिए एक सतत पत्र के रूप में. वे शिखर क्षेत्र में एक बेल्ट की तरह की संरचना के रूप में और है कि ध्रुवीकरण सेल के लिए जो योगदान TJS, से जुड़े रहते हैं. Astrocytes बीबीबी गुणों को विनियमित करने और इस तरह के TGF-β, GDNF, bFGF और आईएल -6 के रूप में महत्वपूर्ण नियामक कारकों के स्रोत हैं. अधूरा कार्यक्षमता के साथ GFAP में कमी astrocytes बीबीबी गुण 4 को विनियमित करने में सक्षम नहीं हैं. न्यूरॉन्स सीधे बीबीबी के गठन में संरचनात्मक रूप से शामिल है लेकिन यह भी प्रोटीन अभिव्यक्ति और बीबीबी कार्यों 5 के महत्वपूर्ण पहलुओं को विनियमित नहीं कर रहे हैं.
आगे बीबीबी की संरचना, शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए, बीबीबी की इन विट्रो मॉडल अनुसंधान उपकरण के रूप में विकसित किया गया. मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं आधारित इन विट्रो बीबीबी मॉडल में लागू करने के लिए विभिन्न प्रजातियों से निकाले गए हैंगोजातीय 6,7 से कम बीतने प्राथमिक संस्कृतियों, सुअर का 8,9, चूहे 10,11,12, माउस 13 और भी मानव 14,15 पर. इन मॉडलों में विवो बीबीबी, नकल करने के लिए जाना जाता है, खासकर जब चूहे या murine और / या pericytes 16,12 से glial कोशिकाओं, और / या तंत्रिका पूर्वज सेल व्युत्पन्न astrocytes 17 और / या न्यूरॉन्स 18 के साथ सह सुसंस्कृत. वे इन विट्रो / vivo प्रयोगों और तुलना और / या ट्रांसजेनिक मॉडल 19 से उत्पादित मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के अध्ययन में अनुमति देते हैं, क्योंकि "में प्रयोगशाला" मॉडल अक्सर कृन्तकों से उत्पादित कर रहे हैं.
हाल में इन विट्रो बीबीबी मॉडल में विकसित भी पूर्व में विवो परीक्षण 15,20,21,3,6,22,11,23 को संभावित सीएनएस दवा उम्मीदवारों के दिमाग तेज भविष्यवाणी करने में मदद करने के लिए डिजाइन किया गया है. इन विट्रो बीबीबी मॉडल आम तौर पर तुलना करने के लिए उपयोग किया जाता है सीएनएस में मैं) में जाना पैठ या एल के साथ: के साथ दवाओं का परिवहनBBB और कोई केंद्रीय प्रभाव भर ओउ पारगम्यता, और द्वितीय) एक ही प्रजाति के पशु मॉडल में मापा एक ही दवाओं के स्पष्ट पे. आसानी से बीबीबी पारित दवाओं है कि ज्यादातर lipophilic हैं और लिपिड की मध्यस्थता मुक्त प्रसार (कैफीन, carbamazepine, आदि) से मस्तिष्क endothelial कोशिका झिल्ली को पार. ऐसे digoxin, verapamil या cyclosporine एक के रूप में नकारात्मक जाया दवाओं सक्रिय रूप से इस तरह के पी जीपी के रूप में मस्तिष्क endothelial तपका ट्रांसपोर्टरों से चली जाती हैं. हालांकि, नव विकसित चिकित्सकीय अणुओं के कई ऐसे पुनः संयोजक प्रोटीन, siRNAs या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के रूप में biopharmaceuticals, कर रहे हैं. विशिष्ट ट्रांसपोर्टरों की मैं) अभाव, और paracellular बीतने के दौर से गुजर से उच्च आणविक भार अणुओं को रोकने के जो endothelial कोशिकाओं के द्वितीय) कसकर बांध परत: उनमें से ज्यादातर के कारण बीबीबी पार नहीं करते. इन सीमाओं के साथ, "ट्रोजन हॉर्स" रणनीतियों मैं, बीबीबी पर जाना जाता रिसेप्टर्स के खिलाफ वैक्टर (एंटीबॉडी, पेप्टाइड्स) शामिल उपयोग कर कार्यान्वित किया गया हैn रिसेप्टर ऐसे transferrin (TF) रिसेप्टर (टीएफआर), इंसुलिन रिसेप्टर (आईआर), या एलडीएल रिसेप्टर (LDLR) से संबंधित रिसेप्टर परिवार (LDLR, LRP1) के सदस्यों के रूप में परिवहन या transcytosis (RMT), मध्यस्थता. इस तरह के रिसेप्टर्स विवो 24,25 में अलग मस्तिष्क केशिकाओं पर और बीबीबी में पाया गया है. इन रिसेप्टर्स के लिए transcriptional प्रोफाइल, विशेष रूप से LDLR परिवार के उन लोगों का विश्लेषण किया और सह सुसंस्कृत सीधे मस्तिष्क 26 से उनकी निकासी के बाद astrocytes के साथ या मस्तिष्क केशिकाओं में मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं और मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के बीच तुलना की गई. Pardridge 24 इंसुलिन रिसेप्टर और इंसुलिन वृद्धि कारक रिसेप्टर 27,28 के खिलाफ एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया, transferrin रिसेप्टर (टीएफआर) के खिलाफ बैल 26 एंटीबॉडी के साथ क्षेत्र खोला. इन एंटीबॉडी आधारित वैक्टर के साथ, ArmaGen टेक्नोलॉजीज बीबीबी 29 के पार, प्रोटीन सहित, दवाएं वितरित करने के लिए एक बीबीबी आणविक ट्रोजन हॉर्स मंच प्रौद्योगिकी विकसित की है.साहित्य LRP1 मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं में अभिव्यक्ति और एक शक्तिशाली endocytic / मेहतर रिसेप्टर के रूप में अपनी भूमिका दिखा डेटा में समृद्ध है. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण LRP1 मस्तिष्क केशिकाओं में समृद्ध भागों में और चूहे के मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं 30 में व्यक्त किया है कि सुझाव दिया. ऐसे बीबीबी 31 के पार कुशल दवा बाढ़ का प्रचार करने वाले aprotinin से व्युत्पन्न पेप्टाइड वैक्टर साथ Angiochem लक्ष्य LRP1 के रूप में कंपनियों. हालांकि, LRP1 भी सक्रिय Aβ के परिवहन और मस्तिष्क पैरेन्काइमा से रक्त 32 को अपने तपका / निकासी में शामिल है. इस तरह के डेटा अपने ligands के आधार पर बीबीबी भर में एक द्वि – दिशात्मक परिवहन में LRP1 शामिल है. biOasis VECT-HORUS LDLR 34 कि लक्ष्य पेप्टाइड वैक्टर विकसित करता है, जबकि इस तरह के बीबीबी 33 के पार lysosomal एंजाइम और एंटीबॉडी के रूप में biologics के परिवहन के लिए एक प्रोटीन melanotransferrin का उपयोग बढकर प्रौद्योगिकी विकसित करता है. डेटा एलआरपी और LDLR अन्तर परिवहन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि वहाँ का सुझाव दे रहा हैऐसे बीबीबी 37 के पार lysosomal एंजाइमों 35,36 या nanoparticle परिसरों के रूप में erent अणुओं.
हमारे हित के क्षेत्र वेक्टर अणुओं और सीएनएस रोगों के उपचार के लिए vectorized दवा उम्मीदवारों का उपयोग सीएनएस के लिए दवा वितरण है. विशेष रूप से, BBB भर दवा वितरण Neuroinflammation अपने हद में भिन्न हो सकते हैं कि एक प्रक्रिया के संदर्भ में विचार किया जाना है, लेकिन है कि इन्सेफेलाइटिस, एकाधिक काठिन्य, अल्जाइमर रोग आदि Neuroinflammation सहित, शायद सभी सीएनएस घावों और बीमारियों के लिए आम है paracellular और transcellular परिवहन रोग की स्थिति 38,39,40,41,42,43 में परिलक्षित किया जा सकता है कि विचार बीबीबी शरीर विज्ञान और पारगम्यता में परिवर्तन के साथ बीबीबी सूजन के साथ और संभवतः जुड़ा हुआ है. उदाहरण के लिए, TNF-α, tweak, और अन्य साइटोकिन्स सूजन मिलाना, और इन विट्रो बीबीबी मॉडल के साथ प्रयोग वे वीं के paracellular गुणों को बदल सकते पता चला है किई endothelial सेल monolayer 38,39,40 और है कि TNF-α भी एलडीएल की 41 transcellular परिवहन में वृद्धि हो जाती है, 42 और लैक्टोफेरिन 43 holotransferrin.
हमारा उद्देश्य को विकसित करने और करने के लिए चिह्नित किया गया था एक अनुकूलित और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चूहा syngeneic बीबीबी मॉडल प्राथमिक मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं और astrocytes के सह संस्कृतियों का उपयोग कर. हम क्रमशः मस्तिष्क endothelial सेल उत्पादन और astrocyte उत्पादन के लिए 5 सप्ताह पुराने और नवजात Wistar चूहों का इस्तेमाल किया. एक चुनौती "साप्ताहिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य" बीबीबी मॉडलों के उत्पादन की अनुमति एक प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए था. इस लक्ष्य तक पहुंचने के लिए, उत्पादन प्रोटोकॉल के हर कदम पहले सप्ताह के बुधवार को मस्तिष्क microvessel उत्पादन से शुरू, सप्ताह के निर्धारित दिनों पर प्रदर्शन किया गया था. Dissections पिछले 3 वर्षों के दौरान लगभग हर हफ्ते प्रदर्शन किया गया. आगे संस्कृतियों के reproducibility में सुधार करने के लिए, एक गुणवत्ता आश्वासन प्रणाली की स्थापना की गई थी. सभी Reagenटीएस और रसायन एक डेटाबेस (प्रवेश की तिथि, स्टॉक, समाप्ति अवधि, आदि) में संदर्भित कर रहे थे.
मॉडल ऐसे endothelial सेल संगठन और शुद्धता के रूप में मानदंडों के एक नंबर, निम्नलिखित विशेषता थी, तीर, भंडारण पारगम्यता, समर्थक भड़काऊ एजेंटों, टी जे प्रोटीन की गुणात्मक और मात्रात्मक अभिव्यक्ति, ऐसे पी जीपी के रूप में तपका ट्रांसपोर्टरों की कार्यक्षमता, और रिसेप्टर्स के जवाब ऐसे टीएफआर या LDLR के रूप में endothelial सेल monolayer भर transcytosis में शामिल किया गया.
हम RBEC की शुद्धि और संस्कृति का पालन और आगे विशेषता बीबीबी गुणों के साथ एक में इन विट्रो बीबीबी मॉडल उत्पन्न करने के लिए प्राथमिक चूहा astrocytes के साथ सह संस्कृतियों की स्थापना, मस्तिष्क microvessels का अलगाव और चढ़ाना के लिए एक साप्ताहिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन का वर्णन है.
सफलतापूर्वक इन विट्रो बीबीबी संस्कृतियों में मानकीकृत स्थापना प्रक्रिया के कई अनुक्रमिक चरणों में इष्टतम स्थितियों की आवश्यकता है. मॉडल (एक) में इन विट्रो बीबीबी मॉडल की "पवित्र कंघी" बनी हुई है, और (ख) तपका और RMT तंत्र के लिए मान्य है, जो सबसे कम paracellular पारगम्यता, प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था.
उत्पादन, शोधन और RBEC का प्रसार
RBEC खेती जब सबसे बड़ी चुनौती अलग संस्कृतियों के बीच reproducibility को प्राप्त है. प्रोटोकॉल के मानकीकरण जिले के लिए उच्च गुणवत्ता वाले उपकरणों की आवश्यकताअनुभाग, उच्च गुणवत्ता वाले अभिकर्मकों और अभिकर्मक समाप्ति तिथियों का सम्मान. प्रयोगकर्ता प्रांतस्था सतह से तानिका और बड़े जहाजों के तेजी से हटाने के लिए stereomicroscope के तहत सूक्ष्म विच्छेदन में कुशल होने की जरूरत है. दिमाग अलग और यंत्रवत् अलग हो जाने के बाद प्रमुख चुनौतियों में से एक हौसले से अलग मस्तिष्क microvessels के इष्टतम enzymatic पाचन है. इस्तेमाल किया एंजाइमों के प्रकार और गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है. बैचों के बीच कम परिवर्तनशीलता के साथ उच्च एकाग्रता में collagenases प्रकार मैं और द्वितीय और dispase का मिश्रण इस्तेमाल किया गया था. इसके अलावा महत्वपूर्ण enzymatic पाचन की अवधि और पाचन के एंजाइम एकाग्रता / ऊतक वजन / मात्रा के बीच का अनुपात है. मस्तिष्क microvessel उत्पादन का सबसे अच्छा उपज 30 मिनट और 1 घंटा क्रमशः, दोनों digestions दौरान 60 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में मिश्रण dispase / collagenases के 1 मिलीलीटर में 1 दिमाग से cortices के समकक्ष के साथ प्राप्त हुई थी.
इसके अलावा महत्वपूर्ण सेल contaminating के उन्मूलन हैएस (astrocytes और मुख्य रूप से pericytes). इन कोशिकाओं endothelial कोशिकाओं की तुलना में अधिक दर पर पैदा करना और इस प्रकार अच्छा paracellular restrictiveness साथ एक सजातीय सेल monolayer की स्थापना को रोकने, बाद के साथ तंग जंक्शनों स्थापित नहीं है. गैर endothelial कोशिकाओं का सफाया कर रहे हैं, जबकि मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं microvessels में पाया अन्य प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में तपका पंपों के बहुत उच्च स्तर, विशेष रूप से पी जीपी, कि एक्सप्रेस को ध्यान में रखते, वे बेहतर पी जीपी ligand दवाओं की अन्यथा विषाक्त सांद्रता बर्दाश्त. पहले दो दिनों के लिए 4 ग्राम / एमएल puromycin उपचार अच्छा endothelial सेल पवित्रता प्राप्त करने के लिए 2 ग्राम / एमएल में दो दिन बाद किया गया. यह चयन भी venules, पूर्व केशिका धमनियों या बड़ा microvessels से उन बनाम केशिका endothelial कोशिकाओं के पक्ष में है, और तंग monolayers करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, गरीब प्लाज्मा व्युत्पन्न गोजातीय सीरम का उपयोग endothelial कोशिकाओं 47,48 का शुद्ध संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए एक जरूरी है. प्लाज्मा डेरived सीरम चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के लिए और इसलिए pericytes के लिए, fibroblasts के लिए mitogenic है जो प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF), अभाव है.
हम चूहे की पूंछ से पारंपरिक रूप से सिफारिश की कोलेजन प्रकार मैं के साथ तुलना में प्रसार उपज का 2 गुना वृद्धि के साथ, चूहों और मानव fibronectin एक महत्वपूर्ण लाभ पैदावार से कोलेजन प्रकार चतुर्थ का मिश्रण के साथ प्लास्टिक और फिल्टर की है कि उपचार मनाया. सेल प्रसार के लिए महत्वपूर्ण cues ऐसे integrin और वृद्धि कारक (bFGF) सक्रियण 49 के रूप में बाह्य मैट्रिक्स द्वारा प्रदान की जाती हैं. बफर एकाग्रता और संस्कृति मीडिया के पीएच paracellular तंगी 50 पर सकारात्मक प्रभाव को वर्णित किया गया है और हम 5 मिमी HEPES बफर के अलावा के साथ संस्कृतियों के बीच एक बेहतर reproducibility मनाया.
सम्मिलित फिल्टर पर सह संस्कृति प्रतिष्ठान: RBEC का भेदभाव
मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं ख है एक बारeen शुद्ध और 6 दिनों के लिए प्रचुर मात्रा में है, वे फिल्टर पर चढ़ाया जा सकता है. उच्च घनत्व सेल चढ़ाना एक आदर्श monolayer प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. 12 अच्छी तरह से थाली फिल्टर प्रति 160×10 3 कोशिकाओं की एक बोने घनत्व बोने के बाद एक मिला हुआ monolayer 24 घंटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक और पर्याप्त था. हालांकि, अपने वातावरण से प्राथमिक मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं के अलगाव यह प्राथमिक कोशिकाओं, और विशेष रूप से मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं, दृढ़ता से अपने वातावरण द्वारा विनियमित और प्रेरक कारकों द्वारा उत्पादित कर रहे हैं कि जाना जाता है के रूप में एक बीबीबी में इन विट्रो मॉडल के निर्माण में एक विरोधाभास है विभिन्न आसपास के प्रकार की कोशिकाओं. ब्रेन केशिका endothelial कोशिकाओं अकेले तेजी से de-को अलग सुसंस्कृत और कुछ विशिष्ट मस्तिष्क endothelial मार्करों ढीला. इस प्रकार, प्राथमिक endothelial कोशिकाओं कम बीतने (P1) में इस्तेमाल किया जाना चाहिए और फिर से जुड़ा हुआ है, कम से कम हिस्से में, astrocytes 47,51 से वातानुकूलित astrocytes या मध्यम साथ सह संस्कृति से अपने वातावरण के साथ. इस रखती हैमस्तिष्क endothelial कोशिकाओं और astrocytes के रूप में astrocyte भेदभाव के लिए सच दो तरह से प्रेरण में शामिल रहे हैं. Astrocytes साथ RBEC संवर्धन interendothelial टी जे 52,23 के मजबूत प्रेरण का नेतृत्व किया. फिर से शामिल की आणविक तंत्र काफी हद तक अनजान रहते हैं, और अनुसंधान के इष्टतम endothelial सेल भेदभाव 53,54 को बढ़ावा देने सकता है जो astrocytes द्वारा स्रावित विशिष्ट modulating कारकों की पहचान करने के लिए कई प्रयोगशालाओं में चल रही है. ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (lif) सहित मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं द्वारा secreted कारक astrocytic भेदभाव 55,56 प्रेरित दिखाया गया है. सह संस्कृति स्थापना से पहले, astrocytes glucocorticoid रिसेप्टर agonist hydrocortisone युक्त भेदभाव मध्यम से अवगत कराया, और सह संस्कृति मध्यम वातानुकूलित थे. Hydrocortisone मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की जकड़न में सुधार करने के लिए जाना जाता है और विशेष रूप से चूहे 57 और माउस 58,59 endothelial कोशिकाओं से बीबीबी मॉडल में प्रयोग किया जाता है. वातानुकूलित मेडीउम 3 दिनों के बाद endothelial सेल / astrocyte सह संस्कृति प्रणाली के निचले डिब्बे से एकत्र की है और बाद में उपयोग के लिए जमे हुए है. सह संस्कृति वातानुकूलित माध्यम का उपयोग 2 अधिक दिनों के लिए इष्टतम paracellular पारगम्यता और संस्कृतियों के बीच में भी सुधार reproducibility के साथ 3 दिनों के लिए endothelial सेल भेदभाव का समय कम कर दिया.
कुल मिलाकर, हम वर्णन प्रोटोकॉल, 0.26 ± 0.11 x 10 -3 सेमी सर्वश्रेष्ठ प्राथमिक सेल आधारित बीबीबी मॉडल 22 के लिए इसी तरह / मिनट, 300 ओम पर एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तीर · 2 सेमी और एक औसत paracellular पारगम्यता गुणांक पीई (भंडारण) पैदावार 12. हम microvessel enzymatic पाचन की प्रस्तावित मॉडुलन के साथ मौजूद पांडुलिपि में वर्णन प्रोटोकॉल चूहे रीढ़ की हड्डी में 60 से और चूहों के मस्तिष्क से endothelial कोशिकाओं को बढ़ाया जा सकता है.
आणविक और कार्यात्मक विशेषता
इसके अलावाटी जे प्रेरण के लिए, astrocytes भी इस तरह के मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं 61 में पी जीपी के रूप में तपका ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति के लिए योगदान करते हैं. हम वास्तव में बीबीबी मॉडल में तपका ट्रांसपोर्टर पी जीपी की अभिव्यक्ति दिखाने के लिए और हम जैव रासायनिक तरीकों का उपयोग कर पी जीपी तपका पंप स्थानीयकरण की ध्रुवता का प्रदर्शन, और पी जीपी गतिविधि का एक कार्यात्मक परख का उपयोग कर. GLT -1 अभिव्यक्ति microvessels के बेसल झिल्ली अंश में खोजा गया था लेकिन सुसंस्कृत RBEC में पता नहीं था. हम GLT -1 नीचे में vivo परिस्थितियों और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा फलस्वरूप detectable नहीं की तुलना में हमारे RBEC संस्कृति में विनियमित किया गया था कि परिकल्पना है. अतिरिक्त ग्लूटामेट न्यूरोटौक्सिक है और इन विवो में, GLT -1 शिखर कम्पार्टमेंट (रक्त परिसंचरण) को बेसल कम्पार्टमेंट (पैरेन्काइमा) से ग्लूटामेट तपका के लिए जिम्मेदार है. Astrocyte संस्कृतियों में, GLT -1 अभिव्यक्ति बहुत कम रहता है और मध्यम 62,63 में ग्लूटामेट के अलावा द्वारा प्रेरित है.
हम भी confआईआरएम ऐसे LRP1, LDLR और टीएफआर रूप में शिखर झिल्ली में बाढ़ ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति. टीएफआर और LDLR की कार्यक्षमता पहले इन विट्रो बीबीबी मॉडल 64 में एक गोजातीय साथ दिखाया के रूप में monolayer के abluminal पक्ष को luminal से TF-Cy3 और DiLDL के प्रयोगों बंधन और परिवहन के साथ प्रदर्शन किया गया. दिलचस्प बात यह है कि astrocytes से कि लिपिड आवश्यकता 65,66 आगे विट्रो में शामिल है, astrocytes और मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के बीच शारीरिक crosstalk की पुष्टि मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं पर LDLR की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है दिखाया गया है. हम फ्लोरोसेंट रंगों के साथ परिवहन उदाहरण देना करने के लिए चुना है ऐसे Cy3 और DiI spectrofluorimetric विश्लेषण सबसे प्रयोगशालाओं में उपलब्ध है, और इन विट्रो बीबीबी मॉडल में मान्य करने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है कि विचार के रूप में. हालांकि, प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव रेडियोधर्मिता से अब तक कम संवेदनशील है और महत्वपूर्ण डेटा प्राप्त करने के लिए प्रयोगों की संख्या में वृद्धि की आवश्यकता है.आदर्श रूप में, TF और एलडीएल ऐसे बंधन / तेज और परिवहन प्रयोगों के लिए आम तौर पर (आयोडीन 125) radiolabeled हैं.
हम यह भी प्रस्तावित प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त विभेदित endothelial सेल monolayer CCL2 जारी है और बीबीबी खोलने से पता चला, TNF-α द्वारा प्रेरित सूजन का जवाब दिखाते हैं. CCL2 (MCP-1) और उसके रिसेप्टर CCR2 एकाधिक काठिन्य, प्रयोगात्मक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) 67, सीएनएस आघात 68 और neuroinflammatory शर्तों 69,70 के तहत सीएनएस में ल्युकोसैट प्रवास के मध्यस्थों के रूप में जाना जाता है के रूप में सीएनएस विकृतियों में शामिल रहे हैं. बीबीबी उद्घाटन CCL2 एकाग्रता ऊपरी (शिखर) और कम (बेसल) डिब्बों दोनों के बीच संतुलित करने की अनुमति देता है क्योंकि परीक्षण किया प्रोटोकॉल के साथ, हम CCL2 की एक polarized स्राव पर समाप्त नहीं कर सकता. नतीजतन, हम स्पष्ट रूप से 24 घंटे (चित्रा 5A) में शिखर डिब्बे में RBEC द्वारा उत्पादित CCL2 की मात्रा कम.
<p class="jove_content"> सामान्य अवलोकन और इन विट्रो मॉडल में बीबीबी की सीमाएं: मैं n विवो बनाम इन विट्रो और कृंतक मानव तुलना बनामइन विट्रो में बीबीबी पारित होने में प्रभावी साबित कर दिया कि कई होनहार सीएनएस दवाओं अक्सर मानव के अलावा अन्य प्रजातियों से अलग कक्षों पर आधारित इन विट्रो बीबीबी मॉडल में से कारण predictability की कमी के चिकित्सीय परीक्षण में विफल रहा है. यह प्रोटीन नेटवर्क, संकेत पारगमन, ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स की यंत्रवत पहलुओं का अध्ययन करने के लिए आता है जब हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए इन विट्रो बीबीबी मॉडल शायद अधिक भविष्य कहनेवाला हैं. इन विट्रो में अध्ययन किया जा हर तंत्र, मार्ग या लक्ष्य एक ही जानवरों की प्रजातियों के साथ पूरक पर्यावरण cues (अन्य प्रकार की कोशिकाओं, रसायन, प्रोटीन) द्वारा अपने विनियमन के लिए विशेषता और सीटू के अध्ययन में संयुक्त करने के लिए किया जाना है, और प्रतिबंध और सावधानी के साथ, मनुष्य से अलग microvessels और endothelial कोशिकाओं के साथ, संभव नीचे पैदा की है.
इन विट्रो में बीबीबी मॉडल शरीर विनियमन से अलग स्वायत्त प्रणाली, के रूप में देखा जाना है, लेकिन अभी भी प्रमुख vivo में गुण और पर्यावरण cues द्वारा विनियमन के लिए एक क्षमता के साथ संपन्न. Endothelial सेल monolayers न्यूरो glia संवहनी इकाई (NGVU) के महत्वपूर्ण घटकों में से एक संख्या की कमी और रक्त और शरीर विनियमन से अलग कर रहे हैं क्योंकि कोई 'आदर्श' इन विट्रो बीबीबी मॉडल अभी तक 71,72,73 प्रस्ताव किया गया है. pericytes 74,16 या न्यूरॉन्स 17,18 या प्लास्टिक कोटिंग या endothelial पर आधारित सबसे आम है और "सबसे आसान बना दिया" इन विट्रो बीबीबी मॉडल में सेल के विकास के लिए इस्तेमाल संस्कृति मध्यम और सीरम के लिए इस्तेमाल बाह्य मैट्रिक्स के विभिन्न घटकों की कमी astrocytes के साथ भेदभाव कोशिकाओं प्रोटीन अभिव्यक्ति मैं मिलाना सकता हैएन vivo स्थिति 75 के साथ तुलना. इन मॉडलों को विवो में प्रदर्शित कई ट्रांसपोर्टरों व्यक्त नहीं, बल्कि सभी सकती है. कुछ मामलों में, परिवहन मापदंडों पहले पृथक microvessels (vivo स्थिति के लिए निकटतम) में सत्यापित किया गया, और फिर सेल संस्कृति प्रणालियों 76,61 में अध्ययन किया.
आण्विक जीव विज्ञान अनुसंधान की अनुमति दी है एक ही प्रजाति से अलग microvessels और कम बीतने endothelial सेल संस्कृतियों में जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लक्षण, और विभिन्न प्रजातियों के बीच, सबसे अधिक बार इस तरह कृन्तकों (चूहों और चूहों) के रूप में या में गाय और सुअर से छोटे जानवरों से मनुष्य 77,78,75,15 की तुलना. Vivo में इन विट्रो मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं में बीच transcriptomic तुलना विभिन्न व्यक्त और सबसे अक्सर काफी विट्रो में downregulated थे कि कई जीन टेप दिखाया. ऐसे टीएफआर और जनसंपर्क के रूप में बाढ़ ट्रांसपोर्टरों एन्कोडिंग देखिएपुटिका तस्करी में फंसा oteins मुख्य रूप से इस तरह की कोशिकाओं में endocytosis और vesicular परिवहन में एक सामान्य कमी का सुझाव दे, सुसंस्कृत मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं में downregulated रहे हैं. पवित्रता (puromycin उपचार) और hydrocortisone के साथ उपचार के संदर्भ में संस्कृति हेरफेर एक अधिक "vivo की तरह" जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल 77 बहाल करने में मदद कर सकते हैं. Transcriptomic पढ़ाई भी. मानव endothelial कोशिकाओं और astrocytes के सह संस्कृति से जुड़े इन विट्रो बीबीबी मॉडल 15 में वर्णित किया गया है आगे इन विट्रो बीबीबी मॉडल 75 में कृंतक पर आधारित मानव में दवा तेज पर भविष्यवाणियों उलझा कि प्रजातियों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का पता चला. प्रासंगिक हालांकि वे पोस्टमार्टम मानव ऊतकों को विनियमित उपयोग की आवश्यकता है और विविधता उम्र, रोगों, और संभवतः चिकित्सा के आधार पर मानव मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की गुणवत्ता / गुण में वहाँ के रूप में, इन मॉडलों के लिए एक नियमित आधार पर लागू करने के लिए और अधिक कठिन हैं treatmenदाताओं की टी. प्रयासों को बेहतर शारीरिक, शारीरिक और vivo में बीबीबी के कार्यात्मक विशेषताओं को पुन: उत्पन्न कि नए इन विट्रो मॉडल विकसित करने के लिए किया जाना है. तीन प्रकार की कोशिकाओं को शामिल सह संस्कृतियों अत्यधिक प्रतिबंधात्मक हैं और नियमित तौर पर लागू करना मुश्किल दिखाई देते हैं. तिथि करने के लिए, सबसे जटिल में इन विट्रो बीबीबी मॉडल, astrocytes के साथ पोत की तरह संगठन शामिल हैं और रक्त प्रवाह 75,79,80,81,82 कि mimics माध्यम की एक प्रवाह में शामिल हैं जो गतिशील इन विट्रो मॉडल (DIV-बीबीबी) कर रहे हैं 83,84,85. मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं एक प्रवाह के संपर्क में हैं, उत्पन्न कतरनी तनाव ऐसी कोशिका विभाजन, भेदभाव, प्रवास और apoptosis के रूप में 80 endothelial सेल फिजियोलॉजी में शामिल विभिन्न जीनों की अभिव्यक्ति मिलाना जो कोशिका की सतह पर mechanotransducers, सक्रिय. में vivo, कतरनी तनाव रक्त प्रवाह द्वारा उत्पन्न की स्थापना परमिट जो सेल से संपर्क करें, पर mitotic गिरफ्तारी के लिए जिम्मेदार हैरक्त वाहिकाओं 80 में endothelial सेल monolayer. सामान्य मानव मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं के जीनोमिक और प्रोटिओमिक विश्लेषण बीबीबी endothelial फिजियोलॉजी 84 में कतरनी तनाव का प्रभाव दिखाया. कतरनी तनाव CYP450 द्वारा मध्यस्थता 75,86, ऑक्सीकरण 75 एंजाइमों और सेल अस्तित्व, endothelial सेल आसंजन के एक उच्च डिग्री, तपका पंप प्रेरण और ट्रांसपोर्टरों 75, ग्लूकोज चयापचय के नियमन की बेहतर ध्रुवीकरण के लिए जिम्मेदार है अभिव्यक्ति में वृद्धि से paracellular पारगम्यता के विनियमन occludin और ZO-1 87,75,80 और फलस्वरूप उच्च तीर की तरह कहनेवाला junctional तत्वों के लिए जीन एन्कोडिंग के चारों ओर 1,500 – 2,000 ओम · सेमी 2, विवो में जाना जाता करने के लिए करीब 79,80 पैरामीटर
जैव प्रौद्योगिकी और दवा उद्योग में, दवाओं या यहां तक कि उच्च throughput स्क्रीनिंग (HTS) और पशु प्रयोग कम करने के प्रयासों की नियमित जांच का नेतृत्व कियासेट अप करने के लिए नियमित तौर पर अधिक मुश्किल बने हुए हैं जो मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति के प्रतिस्थापन में प्रयोग की जाने वाली विभिन्न सेल लाइनों का विकास करने के लिए. ज्यादातर मामलों में, मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों रेट्रोवायरल वैक्टर 88,89,75 का उपयोग प्लास्मिड डीएनए के अभिकर्मक से या संक्रमण से या तो, एक immortalizing जीन (SV40 या polyoma वायरस बड़ी टी प्रतिजन या adenovirus E1A) के साथ transduced थे. मस्तिष्क मूल के कई endothelial सेल लाइनों ऐसे RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, टी.आर. BBBs या rBCEC4 चूहा सेल लाइनों 88,75, b.End3 माउस सेल लाइन 90,75, PBMEC/C1 के रूप में विकसित किया गया है – 2 सुअर का सेल लाइन 87,75, और hCMEC/D3 मानव कोशिका लाइन 89,75. अन्य मॉडल ऐसे Madin-डार्बी कुत्ते गुर्दे (MDCK) या Caco2 सेल लाइनों 12,75 के रूप में गैर मस्तिष्क मूल की कोशिकाओं पर आधारित हैं. विभिन्न मानव मस्तिष्क endothelial सेल लाइनों के बीच, hCMEC/D3 व्यापक रूप से अदालत में तलब किया गया हैडी और 2005 91,92 में अपनी स्थापना के बाद से बीबीबी की एक मॉडल के रूप में सुधार हुआ. प्राथमिक संस्कृतियों, सेल लाइनों वर्तमान फायदे और सीमाओं की तरह. वे प्राथमिक संस्कृतियों से संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं एक विस्तारित जीवन काल है, अच्छी तरह से विशेषता है और बड़े पैमाने पर प्रयोग के बीच reproducibility अनुमति देते हैं. हालांकि, सेल लाइनों, ऊतक विशेष कार्यों खो पर्यावरण विनियमन कम है और इन विवो 75, 89 में कोशिकाओं से काफी अलग एक आणविक फेनोटाइप प्राप्त कर सकते हैं. विशेष रूप से, सेल लाइनों उपस्थित कम जकड़न, कम तीर और शो ट्रांसपोर्टर प्रोफाइल भिन्नता 75,89 से उत्पन्न monolayers. इस प्रकार प्राथमिक कोशिकाओं में पशु प्रयोगों या पढ़ाई अक्सर उनके जोड़ा जटिलता के बावजूद पसंद कर रहे हैं.
The authors have nothing to disclose.
VECT-HORUS को वित्तीय सहायता Fonds अद्वितीय Interministériel (Fui / MEDUL परियोजना) और करने के लिए VECT-HORUS और Agence Nationale डे ला Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, तदर्थ और PREVENTAD सहयोगी परियोजनाओं) से UMR7259 प्रयोगशाला से स्वीकार किया है . UMR7259 प्रयोगशाला भी CNRS से और ऐक्स मारसैल विश्वविद्यालयों से वित्तीय समर्थन मानता है.
Product | Company | Catalog Number | Comments / expiration term |
BSA fraction V low endotoxin | PAA | K45-011-500g | 4 °C |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | - 20 °C |
0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-054 | - 20 °C |
DMEM High Glucose | Invitrogen | 61965-026 | 4 °C |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10270-098 | - 20 °C / 1 year |
T75 flasks | Becton Dickinson Falcon | 353135 | |
HEPES buffer (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | 4 °C / 1 year |
Collagene type IV mouse (10 x 1 mg) | Becton Dickinson | 356233 | - 20 °C / 1 month |
Fibronectin humain plasma (5 mg) | Becton Dickinson | 356008 | - 20 °C / 1 month |
Vannas Spring Scissors, straight (9 cm) | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Scissors, straight (9 cm) | Fine Science Tools | 14568-09 | |
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Graefe Forceps, tip width 0,8 mm | Fine Science Tools | 11050-10 | |
Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg) | Roche Diagnostics | 05 401 054 001 | – 20 °C / 3 months |
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) | Sigma Aldrich | DN25-100 mg | - 20 °C / 1 year |
Gentamicin (10 mg/mL) | Invitrogen | 15710-049 | 4 °C / 1 year |
DMEM/F12 | Invitrogen | 31331-028 | 4 °C |
Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL) | Clinisciences | BT-214-100 | - 20 °C / 1 year |
bFGF (10 µg) | Invitrogen | 13256-029 | - 20 °C / 6 months |
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I | Sigma Aldrich | H3149-100KU | 4 °C / 1 year |
Puromycin | Sigma Aldrich | P8833-10 mg | - 20 °C / 6 months |
ITSX | Invitrogen | 51500-056 | 4 °C / 1 year |
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates | Millipore | PIRP15R48 | Porosity: 1 µm Surface: 1,1 cm2 |
Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1 g | - 20 °C / 1 year |
Mouse anti-CD31 / PECAM | Chemicon | MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) | 1/200 – fixation PFA 4% |
Rabbit anti-Von Willebrand | Chemicon | AB7356 | 1/200 – fixation PFA 4% |
Mouse anti-Desmine | Chemicon | MAB3430 | 1/200 – fixation PFA 4% |
Mouse anti-Vimentine | Invitrogen, Zymed | 08-0052 clone V9, (58 µg/mL) | 1/50 – fixation PFA 4% |
Mouse anti-Claudin-5 | Invitrogen, Zymed | 35-2500, (500 µg/mL) | 1/200 – fixation PFA 4% |
Rabbit anti-ZO-1 | Invitrogen, Zymed | 61-7300 (250 µg/mL) | 1/200 – fixation PFA 4% |
Rabbit anti-Occludine | Invitrogen, Zymed | 71-1500 (250 µg/mL) | 1/200 – fixation PFA 4% |
Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies | Invitrogen | 1/800 | |
Lucifer yellow CH, dilithium salt | Sigma Aldrich | L0259 | - 20 °C |
TNF-a Human | PeproTech | 300-01A | - 20 °C |
Rat MCP-1 ELISA Kit | PeproTech | 900-K59 | 4 °C / – 20 °C |
Mouse anti-P-glycoprotein | Covance, Eurogentec | SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) | 1/400 – fixation PFA 4% 1/200 (western blot) |
Rabbit anti-GLT-1 | Abcam | ab41621 | 1/1000 (western blot) |
Rhodamine 123 | Sigma Aldrich | 83702 | 4 °C |
Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich | V4629 | 4 °C |
Cyclosporine A | Sigma Aldrich | 30024 | 4 °C |
Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat | American Diagnostica | 3501 (100 µg/mL) | 1/5 – fixation PFA 4% |
Mouse anti-LDLR | R&D systems | AF2255 (200 µg/mL) | 1/50 – fixation PFA 4% |
Rat transferrin-Cy3 | Gentaur | JOR160050 | 4 °C |
DiILDL | Invitrogen | L-3482 | 4 °C |