迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索
Summary
ここでは、急速にPhenoRipper、最近開発された画像解析プラットフォームを用いた蛍光顕微鏡画像の集合を分析し、探索するためのワークフローを記載している。
Abstract
ハイスループット顕微鏡法の急速な進歩にもかかわらず、定量的な画像ベースのアッセイは、依然として重大な課題を提起する。専門的な画像解析のさまざまなツールが利用可能であるが、最も伝統的な画像解析ベースのワークフローは、（解析パラメータの微調整のために）急な学習曲線を持っているとイメージングと解析間の長いターンアラウンド時間をもたらす。具体的には、細胞分割は、画像内の個々のセルを識別するプロセスは、この点での主なボトルネックである。
ここでは、代替、PhenoRipper、顕微鏡画像の迅速な分析と探査のために設計されたオープンソースのソフトウェアプラットフォームに基づいて、セルセグメンテーションないワークフローを紹介。ここで紹介するパイプラインは、細胞培養の免疫蛍光顕微鏡画像用に最適化されており、最小限のユーザの介入を必要としている。 30分以内に、PhenoRipperは、典型的な96ウェル実験からのデータを解析し、画像のプロファイルを生成することができる。ユーザーことができます目視、そのデータを調査、その実験に品質管理を行う、摂動に対する応答性を確保し、反復実験の再現性を確認してください。これは、アッセイの最適化の際に非常に重要である、解析と実験の間の迅速なフィードバックサイクルを容易にします。このプロトコルだけでなく、品質管理のための最初のパス解析として有用であるだけでなく、エンドツーエンドのソリューションとして使用することができる、特にスクリーニングのため。ここで説明したワークフローは、例えば、ハイスループットスクリーニングによって生成されるような大規模なデータセットに拡張し、正確に生物系の広範囲の表現型によって基実験条件に示されている。 PhenoBrowserインタフェースは、表現型の空間を探索し、生物学的な注釈に画像のプロパティを関連付けるための直感的なフレームワークを提供します。一緒になって、ここに記載されているプロトコルは、イメージベースのスクリーニングの定量分析を採用への障壁を低くします。
Introduction
過去10年間で、画像技術の急速な進歩は、多くのラボのハイスループット顕微鏡法を実行する能力を与えている。現在の課題は、分析の1に画像の1から移行している。どのように我々は、特性評価の比較、および、典型的なハイスループット撮像画面で生成された複雑なまだ微妙な表現型の急流を探索することができます？
画像解析と情報プラットフォームの数は、画像の大規模なコレクションからの生物学的情報を抽出するためのユーザー洗練されたツールボックスの1-3を与えている。しかし、多くの重大な障害は、高スループットの画像ベースの画面からデータを分析するにとどまる。 （興味のあるシステムへの）イメージとアルゴリズムパラメータの微調整の適切な特徴付けを選択することに関わる困難さは、多くの場合、特に画像解析の専門知識を持たないユーザーのための長いセットアップ時間をもたらす。具体的には、細胞分割、内の個々の細胞を同定する工程n個の画像は、この点での主なボトルネックである。セグメンテーションは、細胞型、細胞密度、バイオマーカーなどの実験パラメータに非常に敏感であり、頻繁には大きなデータセットに対して繰り返し調整を必要とすることができる。これらの理由から、画像解析は、多くの場合、専門家ではなく、実験的なワークフローの一部として統合することによって実施した独立端末工程である。これは解析と実験の間の迅速なフィードバックサイクル、アッセイ開発の重要な部分を排除する。
ここでは、ハイスループット蛍光顕微鏡用に最適化され、前述の問題点の多くを回避している別のワークフローを記載している。この目的のために、我々はPhenoRipper 4、顕微鏡画像の迅速な調査と分析のためのオープンソース·ソフトウェア·プラットフォームを利用しています。重要なことは、PhenoRipperは、単一の細胞を同定しようとしていないことにより、細胞の分割に関わる課題の多くを避けることができます。その代わり、PhenoRipperは画素に画像を分割細胞内のサイズのブロックとそこに含まれるブロック単位で画像を特徴付ける。具体的には、PhenoRipperはマーカーの共局在ベースの機能の面でブロックをプロファイルし、自動的に訓練画像の中で最も代表的なブロックタイプの4識別します。 PhenoRipperは、各ブロック最も類似する代表的なブロックタイプに割り当て、最終的にそれらが含むブロックの種類に基づいて画像を特徴付ける。
より伝統的な単一セルベースのアプローチと比較すると、このアプローチは、最小限の微調整と専門知識を必要とします。ブロックサイズと閾値強度（画像の非細胞部分を破棄すること）、グラフィカルなフィードバックが設定され、どちらも：そのように、ユーザーは二つのパラメータを設定する必要があります。重要なことに、ここで説明したワークフローは、速度と最小限の微調整が大きく、時間と信頼性の向上を提供する非常に大きなデータセットに容易に拡張する4が示されている。実際には、我々はこのアプリがわかりローチは、両方の大きさは4の倍数桁のセットアップと実行に必要な時間が短縮されます。
PhenoRipperのプライマリ出力は、細胞が同様の表現型を表示させる実験条件のグループを識別することを可能にする、画像類似度を視覚的に表現したものである。一般的に見つけPhenoRipperグループ化は、より多くの時間がかかり、セル·ベースの方法4によって生成されたものに匹敵する「生物学的解釈可能」を持っている。実際には、これは、しばしば、典型的な96ウェル蛍光顕微鏡実験を行った30分以内に、前の画像解析経験のない実験者が彼または彼女の実験のパフォーマンスに関する信頼性の高い読み出しを得ることができることを意味する。実験者は次いで、異なる実験条件間の関係を探索を開始し、画像の表現型へのこれらの関係に関連することができる。
私たちは、効果を分析することによって、このワークフローを実証DNAや細胞骨格マーカーについて染色HeLa細胞上の異なるメカニズムのクラスにおける薬物の。薬の同じクラスで処理された細胞の画像がグループ化され、（というように、フォーカス細胞外染色のアーティファクト、）悪い品質の画像を識別し、潜在的に破棄するためにそれらが容易、外れ値として登場した。
このワークフローは、画像ベースの多数のアッセイのために有用であるが、別のアプローチは、潜在的に、より有益である可能性が明らかに多くの状況があります。例えば、PhenoRipperからの出力は、主に実験条件間での蛍光パターンの相対比較である。特定の単一細胞形質の絶対的特徴付けは、（セル内のスペックルの例えば数）の代わりに必要とされた場合、単一細胞ベースの分析が必要とされるであろう。それにもかかわらず、さらにこの種の状況において、PhenoRipperは、これらの単一細胞の表現型の変化を検出し、従って、アッセイの最適ための有用なツールである可能性が高いmization。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するワークフローは、迅速かつ簡単に特性評価と顕微鏡画像の比較を可能にする。まず、このワークフローを迅速顕微鏡画像上の品質管理を行うことで、例えば、実験の最適化を助けることができる方法を説明しました。次に、我々は、ハイスループットスクリーニングデータを解析するための可能性を実証：我々は、それらの作用機序に基づいてグループ薬物することができた?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、アダム·コスターで親切なフィードバックや議論のためのAltschulerと呉ラボの他のすべてのメンバーに感謝。この研究は、米国国立衛生研究所によってサポートされていましたR01 GM085442とCA133253（SJA）、R01 GM081549（LFW）、CPRIT RP10900（LFW）、およびウェルチ財団、I-1619（SJA）とI-1644（LFW）を付与します。
Materials
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used :0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used :20 μM | ||
| Colchicine | concentration used :0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used :0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used :0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used :0.2 μM | ||
| M344 | concentration used :20 μM | ||
| MS-275 | concentration used :5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used :0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used :0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used :0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used :70 μM | ||
| Taxol | concentration used :0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used :0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used :0.3 μM |
References
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