신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사
Summary
여기에서 우리는 빠르게 PhenoRipper, 최근에 개발 된 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 형광 현미경 이미지의 컬렉션을 분석하고 탐구를위한 워크 플로를 설명합니다.
Abstract
높은 처리량 현미경의 급속한 발전에도 불구하고, 정량적 인 이미지 기반 분석은 여전히 중요한 도전을 제기. 전문 영상 분석 툴의 다양한 사용할 수 있지만, 대부분의 전통적인 이미지 분석 기반의 워크 플로우 (분석 매개 변수를 미세 조정에 대한) 가파른 학습 곡선을 가지고 이미징 및 분석 간의 긴 처리 시간에 발생합니다. 특히, 셀 분할은 이미지의 개별 셀을 식별하는 프로세스는,이 점에서 주요 병목 현상이다.
여기에서 우리는 PhenoRipper, 신속한 분석 및 현미경 이미지의 탐험을 위해 디자인 된 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼을 기반으로 대체, 세포 분할이없는 워크 플로우를 제시한다. 여기에 제시된 파이프 라인은 세포 배양의 면역 형광 현미경 이미지를 최적화하고 최소한의 사용자 개입이 필요합니다. 반 시간 내 PhenoRipper은 일반적인 96 – 웰 실험 데이터를 분석하고 이미지의 프로파일을 생성 할 수 있습니다. 사용자 수다음 시각적으로 데이터를 탐색 자신의 실험에 품질 관리를 실시하고, 섭동에 대한 응답을 보장하고 반복 실험의 재현성을 확인합니다. 이 분석 및 분석 최적화시 매우 중요합니다 실험 사이의 신속한 피드백주기를 용이하게한다. 이 프로토콜은 단지 품질 관리를위한 제 1 패스 분석으로서 유용하지만 엔드 투 엔드 솔루션으로 사용될 수 있고, 특히 스크리닝. 여기에서 설명한 워크 플로우는 높은 처리량 스크린에 의해 생성 된 것과 같은 큰 데이터 세트로 스케일링하고, 정확하게 생물학적 시스템의 넓은 범위 표현형에 의해 그룹 실험 조건에 도시되었다. PhenoBrowser 인터페이스는 표현형 공간을 탐구하고 생물 주석에 이미지 속성을 관련하는 직관적 인 프레임 워크를 제공합니다. 종합적으로, 여기에 설명 된 프로토콜을 기반으로 화상 스크린의 정량 분석을 채택하는 장벽을 낮출 것이다.
Introduction
지난 10 년 동안 이미징 기술의 급속한 진보는 많은 실험실에게 높은 처리량 현미경을 수행 할 수있는 능력을 부여 하였다. 문제는 지금 분석 중 하나에 이미지 중 하나를 이동했다. 우리는 어떻게 비교, 특성, 그리고 일반적인 높은 처리량 영상 화면에 생성 된 복잡한 아직 미묘한 표현형의 급류를 탐험 할 수 있습니까?
이미지 분석 및 정보학 플랫폼의 숫자는 이미지의 큰 컬렉션에서 생체 정보를 추출하기위한 사용자 정교한 도구 상자 1-3을 받고 있습니다. 그러나 많은 중요한 장애물은 높은 처리량 이미지 기반 화면에서 데이터를 분석 남아있다. (그 시스템) 이미지와 알고리즘 파라미터의 미세 조정의 적절한 특성화를 선택과 관련된 어려움은 종종 특히 이미지 분석 전문 지식이없는 사용자를 위해 긴 설치 시간에 발생합니다. 특히, 셀 분할, 개별 셀을 식별하는 프로세스해당 화상은,이 점에서 주요 병목 현상이다. 분할은 세포 유형, 세포 밀도와 바이오 마커와 같은 실험적인 매개 변수에 매우 민감하고, 자주 큰 데이터 세트에 대한 반복 조정을 필요로 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 이미지 분석은 종종 오히려 실험 플로의 통합 부분보다 전문가에 의해 수행 독립적 단말 단계이다. 이 분석 및 실험, 분석 개발의 중요한 부분의 신속한 피드백주기를 배제한다.
여기에서 우리는 높은 처리량의 형광 현미경에 최적화 상기 어려움의 많은 것을 방지하는 다른 워크 플로우에 대해 설명합니다. 이를 위해, 우리는 PhenoRipper 4, 빠른 탐사 및 현미경 이미지 분석을위한 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼을 사용합니다. 중요한 것은, PhenoRipper 단일 세포를 식별하려고 시도하지 않음으로써 세포 분할과 관련된 여러 가지 문제를 피할 수 있습니다. 대신, PhenoRipper 픽셀로 이미지를 분할세포 내 크기의 블록들이 포함 된 블록의 측면에서 이미지를 특징. 특히, PhenoRipper 마커 – colocalization을 기반 기능의 측면에서 블록을 프로파일 자동 교육 이미지의 가장 대표적인 유형을 차단 4 식별합니다. PhenoRipper 다음 각 블록과 가장 유사한 대표 블록 타입에 할당하고, 마지막에 포함 된 블록의 종류에 따라 이미지를 특징.
전통적인 단일 셀 기반의 접근 방식에 비해,이 방법은 최소한의 미세 조정과 전문 지식을 필요로합니다. 블록 크기와 그래픽 피드백을 설정 둘 임계 강도 (이미지의 비 세포 부분을 폐기) : 이와 같이, 사용자는 두 개의 매개 변수를 설정해야합니다. 중요한 것은, 여기에 설명 된 워크 플로는 속도와 최소한의 미세 조정이 큰 시간과 신뢰성 향상을 제공 훨씬 더 큰 데이터 세트를 쉽게 확장 4를 보였다. 실제로, 우리는 발견이이 응용 프로그램바퀴벌레는 모두 크기가 4의 배수 주문하여 설치 및 실행에 필요한 시간을 줄일 수 있습니다.
PhenoRipper의 기본 출력은 세포가 유사한 표현형을 표시하는 원인이 실험 조건의 그룹을 식별하기 위해 사용자를 가능하게하는 이미지의 유사성을 시각적으로 표시 한 것입니다. 일반적으로 발견 PhenoRipper 그룹화는 더 많은 시간이 소요되는, 세포 기반 방법 (4)에 의해 생성 된 것과 비교 "생물학적 해석 가능성"이. 실제로, 이것은 종종, 전형적인 96 – 웰 형광 현미경 실험을 행하는 반 시간 내에, 종래 이미지 분석 경험이없는 실험자가 자신의 실험의 성능에 대한 신뢰성있는 판독을 얻을 수 있다는 것을 의미한다. 실험은 다른 실험 조건 사이의 관계를 탐구하고 이미지 표현형에 이러한 관계의 관계를 시작할 수 있습니다.
우리는 효과를 분석하여 여기에이 워크 플로를 보여DNA와 세포 골격 마커 스테인드 HeLa 세포에 별개의 기계적인 클래스의 약물. 약물의 같은 클래스로 처리 된 세포의 이미지가 함께 그룹화하고, (그래서에 초점을 세포 밖으로 염색 유물)별로 품질의 이미지를 식별하고 잠재적으로 폐기하기가 용이하고, 아웃 라이어로 등장했다.
이 워크 플로는 이미지 기반 분석의 큰 숫자에 대한 유용하지만, 다른 방법이 잠재적으로 더 많은 정보를 될 수 분명히 많은 경우가 있습니다. 예를 들어, PhenoRipper로부터의 출력은 주로 실험 조건에 걸쳐 형광 패턴의 상대적인 비교이다. 특정 단일 세포 형질의 절대적 특성화가 (셀의 얼룩 무늬의 예 번호) 대신에 필요한 경우, 단일 세포 기반 분석이 요구된다. 그럼에도 불구하고, 심지어 이러한 유형의 상황에서, PhenoRipper이 단일 셀 표현형의 변화를 감지 할 가능성이 있으므로 분석 OPTI를위한 유용한 도구가 될 수mization.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 워크 플로는 빠르고 쉬운 특성과 현미경 이미지의 비교를 할 수 있습니다. 우리는 먼저이 워크 플로는 빠르게 현미경 이미지에 대한 품질 관리를 수행하여, 예를 들어 실험의 최적화를 할 수있는 방법을 보여 주었다. 다음으로, 우리는 높은 처리량 검사 데이터를 분석에 대한 가능성을 보여 주었다 : 우리는 그들의 행동 메커니즘을 기반으로 그룹의 약물에 수 있었다. 약물의 그룹?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 아담 코스터와 도움의 의견과 토론 Altschuler와 우 실험실의 다른 모든 구성원 감사합니다. 이 연구는 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다 R01 GM085442 및 CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), 그리고 웰치 재단 I-1619 (SJA)를 부여하고 I-1644 (LFW).
Materials
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used :0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used :20 μM | ||
| Colchicine | concentration used :0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used :0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used :0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used :0.2 μM | ||
| M344 | concentration used :20 μM | ||
| MS-275 | concentration used :5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used :0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used :0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used :0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used :70 μM | ||
| Taxol | concentration used :0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used :0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used :0.3 μM |
References
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