Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images
Summary
Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho para rapidamente analisar e explorar coleções de imagens de microscopia de fluorescência usando PhenoRipper, uma plataforma de análise de imagem recentemente desenvolvido.
Abstract
Apesar de rápidos avanços na microscopia de alto rendimento, ensaios baseados em imagem quantitativos ainda representam desafios significativos. Embora uma variedade de ferramentas de análise de imagem especializados estão disponíveis, a maioria dos fluxos de trabalho baseados em imagem-análise tradicionais têm curvas de aprendizado íngremes (para ajuste fino dos parâmetros da análise) e resultar em longos tempos de resposta entre imagem e análise. Em particular, a segmentação das células, o processo de identificação de células individuais de uma imagem, é um importante ponto de estrangulamento, a este respeito.
Apresentamos aqui, um fluxo de trabalho livre de segmentação de células-alternativo baseado em PhenoRipper, uma plataforma de software de código aberto projetado para a análise e exploração de imagens de microscopia rápida. O gasoduto apresentado aqui é otimizada para imagens de microscopia de imunofluorescência de culturas celulares e exige intervenção mínima do usuário. Dentro de meia hora, PhenoRipper pode analisar os dados a partir de um típico de 96 poços experimental e gerar perfis de imagem. Os usuários podemem seguida, explorar visualmente os seus dados, realizar o controle de qualidade em sua experiência, garantir uma resposta às perturbações e verificar a reprodutibilidade de repetições. Isso facilita um ciclo de feedback rápido entre análise e experiência, o que é crucial durante a otimização do ensaio. Este protocolo é útil não apenas como uma análise de primeira passagem para o controlo de qualidade, mas também pode ser usado como uma solução de ponta-a-ponta, especialmente para o rastreio. O fluxo de trabalho descrito aqui dimensionado para grandes conjuntos de dados, tais como os gerados por telas de alto rendimento, e tem sido demonstrado que grupos de condições experimentais pelo fenótipo com precisão ao longo de uma vasta gama de sistemas biológicos. A interface PhenoBrowser fornece uma estrutura intuitiva para explorar o espaço fenotípica e relacionar as propriedades de imagem para anotações biológicas. Tomados em conjunto, o protocolo descrito aqui vai diminuir as barreiras para a adoção de análise quantitativa de telas de imagem baseado.
Introduction
Ao longo da última década, os avanços rápidos na tecnologia de imagem têm dado muitos laboratórios a capacidade de realizar microscopia de alto rendimento. O desafio agora mudou de uma das imagens de uma das análises. Como podemos caracterizar, comparar e explorar a torrente de fenótipos ainda sutis complexas geradas por uma tela de imagem típico de alto rendimento?
Um número de imagem de análise e de informática plataformas deram usuários caixas de ferramentas sofisticadas 1-3 para a extração de informação biológica de grandes coleções de imagens. No entanto, muitos obstáculos significativos permanecem na análise de dados de telas com base em imagens de alto rendimento. Dificuldades com a escolha de caracterizações adequadas das imagens e ajuste fino de parâmetros algorítmicos (para o sistema de juros) muitas vezes resultam em longos tempos de preparação, especialmente para usuários sem conhecimentos de análise de imagem. Em particular, a segmentação das células, o processo de identificação de células individuais numaimagem n, é um gargalo importante a este respeito. A segmentação pode ser altamente sensível aos parâmetros experimentais, tais como tipo de célula, a densidade celular e bio-marcadores, e frequentemente requer ajuste repetido para um grande conjunto de dados. Por estas razões, a análise de imagem é muitas vezes um passo independente, o terminal realizadas pelos especialistas, em vez de uma parte integrada do fluxo de trabalho experimental. Isto impede o ciclo de feedback rápido entre análise e experiência, uma parte crucial do desenvolvimento do ensaio.
Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho alternativo que é otimizado para a microscopia de fluorescência de alto rendimento e evita muitas das dificuldades acima mencionadas. Para isso, fazemos uso de PhenoRipper 4, uma plataforma de software de código aberto para a exploração e análise de imagens de microscopia rápida. Significativamente, PhenoRipper evita muitos dos desafios envolvidos com a segmentação celular por não tentar identificar células individuais. Em vez disso, PhenoRipper divide a imagem em pixelsblocos de tamanho sub-celular e caracteriza imagens em termos de blocos que contêm. Especificamente, PhenoRipper perfis blocos em termos de co-localização com base em marcadores de recursos e automaticamente identifica quatro tipos mais representativos do bloco nas imagens de treinamento. PhenoRipper depois atribui a cada bloco do tipo de bloco mais representativo semelhante, e, finalmente, caracteriza imagens com base nos tipos de blocos que contêm.
Comparado a-baseados em células únicas abordagens mais tradicionais, esta abordagem exige sintonia fina mínima e especialização. Como tal, os usuários só precisa definir dois parâmetros: o tamanho do bloco e uma intensidade limiar (para descartar porções alveolares de uma imagem), os quais são definidos com feedback gráfica. É importante ressaltar que o fluxo de trabalho descrito aqui foi mostrado 4 de escalar facilmente para conjuntos de dados muito maiores, onde a velocidade e afinação mínima fornece grande tempo e ganhos de confiabilidade. Na prática, vemos que este aplicativoroach reduz o tempo necessário tanto para a instalação e funcionamento por várias ordens de magnitude 4.
A saída primária de PhenoRipper é uma representação visual da imagem semelhança, que permite ao usuário para identificar grupos de condições experimentais que causam as células para exibir fenótipos semelhantes. Os agrupamentos PhenoRipper encontra normalmente têm "interpretabilidade biológica" comparável com aqueles gerados por mais, os métodos baseados em células demoradas 4. Na prática, isso significa que, muitas vezes, dentro de meia hora de realizar um típico 96 poços experimento microscopia de fluorescência, um experimentador sem experiência de imagem de análise prévia pode obter uma leitura confiável sobre o desempenho de seu experimento. O experimentador pode, então, começar a explorar as relações entre as diferentes condições experimentais e relacionando estas relações para fenótipos de imagem.
Demonstramos esse fluxo de trabalho aqui, analisando os efeitosde drogas nas aulas mecanicistas distintos sobre as células HeLa coradas para marcadores de DNA e do citoesqueleto. Imagens de células tratadas com a mesma classe de drogas foram agrupados, e imagens de baixa qualidade (artefatos de coloração, fora das células de foco e assim por diante) apareceu como discrepantes, tornando-os fáceis de identificar e, potencialmente, descartar.
Enquanto o fluxo de trabalho é útil para um grande número de ensaios com base em imagens, é evidente que existem muitas situações em que uma abordagem diferente poderia ser potencialmente mais informativa. Por exemplo, a saída de PhenoRipper é principalmente uma comparação relativa dos padrões de fluorescência em diferentes condições experimentais. Se uma caracterização absoluta de uma característica única célula específica foi necessária em vez (por exemplo, o número de manchas de uma célula), uma única célula com base na análise seria necessária. Todavia, mesmo neste tipo de situação, é provável que PhenoRipper detectar mudanças nesses fenótipos de uma única célula e, portanto, ser uma ferramenta útil para o ensaio optização.
Protocol
Representative Results
Discussion
O fluxo de trabalho descrito aqui permite a caracterização e comparação de imagens de microscopia fácil e rápido. Primeiro, demonstrou como esse fluxo de trabalho pode ajudar a otimização experiência, por exemplo, realizando rapidamente o controle de qualidade em imagens de microscopia. Em seguida, demonstrou seu potencial para a análise de dados high-throughput screening: fomos capazes de drogas do grupo com base em seu mecanismo de ação. O agrupamento de drogas foi comparável à observada usando métodos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Adam Coster e todos os outros membros dos laboratórios Altschuler e Wu para feedback útil e discussões. Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de Saúde concede R01 GM085442 e CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), ea Fundação Welch I-1619 (SJA) e I-1644 (LFW).
Materials
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used :0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used :20 μM | ||
| Colchicine | concentration used :0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used :0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used :0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used :0.2 μM | ||
| M344 | concentration used :20 μM | ||
| MS-275 | concentration used :5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used :0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used :0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used :0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used :70 μM | ||
| Taxol | concentration used :0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used :0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used :0.3 μM |
References
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm – an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. 2, 1139-1142 (2004).
