수지상 세포 (DC가) nigericin와 NLRP3의 inflammasome을 활성화 한 다음 합성 퓨린, R848의 TLR8 인식에 응답하여 IL-1β 분비, 따라서 IL-1β는 NLRP3의 inflammasome을 활동을 측정하는데 사용될 수있다. 세포 내 사이토 카인 염색법, 면역 블롯 및 ELISA 정확하게 IL-1β의 발현을 통해 NLRP3의 프라이밍 inflammasome을 및 활성화를 측정하는 데 사용됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정
이 논문에서
요약
초록
인터루킨의 분비 (IL)으로 인해 발생하는 염증성 과정 -1 면역 세포에 의해 가족의 사이토 카인이 로컬 또는 전신 염증, 조직 리모델링 및 수리, 및 바이러스 학적 제어 1, 2로 이어집니다. 인터루킨-1β는 타고난 면역 반응에 필수적인 요소이며 지속적인 감염 1-5의 설립을 방지하면서 병원균 침입 제거에 기여한다.
Inflammasomes 1 전환 효소 (ICE 또는 카스파 1) 인터루킨의 활성화를위한 키 신호 플랫폼이다. NLRP3의 inflammasome을은 IL-1β 분비 6을 일으키는 DC가 적어도 두 개의 신호가 필요합니다. 프로 IL-1β 단백질 발현이 세포를 휴식에 제한된다; 따라서 프라이밍 신호는 IL-1β의 전사 및 단백질 발현에 필요합니다. 다중 단백질 NLRP3 inflammasome을 이용의 형성 NLRP3 결과에 의해 감지 제 2 신호. IR 업무 수지상 세포의 기능IL-1β 분비에 필요한 신호 D는 박테리아 독소와 NLRP3의 inflammasome을 활성화 한 다음 주요 세포 돌기 세포 (moDCs)을 파생 사람의 단핵구에서 TLR8에 의해 감지되는 합성 퓨린, R848을 사용하여 테스트 할 수 있습니다 칼륨 이온 운반체, nigericin.
단핵구 유래 수지상 쉽게 문화의 생산과 정제 된 인간의 골수의 수지상보다 훨씬 더 많은 세포를 제공한다. 그 대신 파생 마우스, DC가, 따라서 인간의 질병과 감염에 inflammasome을의 연구를 허용 체외 인간에 사용하는 여기에 제시된 방법은 다른 inflammasome을 분석 실험 다릅니다.
서론
타고난 면역 시스템의 활성화는 감염, 질병, 예방 접종 7시 적응 면역 반응을 조종하는 데 필요합니다. 수지상 세포는 선천성 면역 체계의 세포를 제시하는 가장 강력한 항원이다; 그들은 항원의 흡수, 림프절 마이그레이션, 순진 CD4 +와 CD8 + T 세포 용해 세포 8-10의 활성화를 위해 전문화되어 있습니다. 빠른 병원체 검출을 사용하려면 타고난 면역 시스템은 보존 병원체 파생 모티브 또는 세포 스트레스와 손상의 호스트 파생 마커를 인식하는 수많은 생식 인코딩 패턴 인식 수용체 (PRR)를 사용합니다. 수용체 (TLR에) 같은 전화는 특정 세포 phagocytized 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS) 및 위험 관련 분자 패턴 (감쇠)를 인식 막 결합 패턴 인식 수용체이다. 수용체 (NLRs) 같은 대비 고개를 끄덕으로 세포질하고 PAMPS 및 감쇠의 다양한 범위에 응답합니다. 수용체가 다시 같이 고개를 끄덕세포 표면 및 세포 내 이입 PRRS을 회피 병원균에 대한 방어의 두 번째 라인을 제시한다. 파생 병원균, 또는 "위험"의 상호 작용, 관련 TLR과 NLR 리간드 요소는 다른 면역 세포와 T 세포와 자연 살해 세포 활성화 (11)의 승진 증가 DC의 상호 작용의 결과로 DC의 성숙의....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
윤리 정책 : 연구 샘플을 얻어 기증자의 동의와 연구에 저장됩니다. 모든 샘플 코드 또는 사용하기 전에 익명으로 처리해야한다. 이 프로토콜은 우리의 임상 시험 심사위원회의 가이드 라인을 따른다.
1. 단핵구 유래 수지상 세포에 인간의 말초 혈액 단핵구의 분화.
참고 : 인간 버피 코트는 인간의 말초 혈액 세포 (PBMC를)의 소스 역할을하고 뉴욕 혈액 센터 (뉴욕, NY)에서 얻을 수 있었다. 혈액 기증자는 건강한 지원자입니다. 오일 절차는 조직 배양에 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 도금을 시작은 35,36을 플라스. 게시 된 프로토콜에서 주목할만한 차이점은 다음과 같습니다 :
- 10cm 폴리스티렌 조직 배양 플레이트보기 플라스크 당 2 × 13의 PBMC를 다운로드 고착 대신하는 필터 캡 225cm이 비 발열 폴리스티렌 조직 배양 플라스크를 사용S (58cm 2) (1 단계).
- 5 % 풀링 된 인간 혈청 (PHS, 30 ㎖)으로 미디어를 준비 500 ML RPMI-1640 + L-글루타민, 5 ㎖ 1 M HEPES 버퍼, 1.4 ㎖의 50 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이 기술은 R848 프라이머를 TLR8을 측정합니다. 의 CD11c + moDCs - 프로 IL-1β에 대한 세포 내 사이토 카인 염색법은 CD14에서 현미경 및 외과 판독 할 수 있습니다. 두 기술은 프라이머 비, 또는 휴식, 휴대폰 제어뿐만 아니라 이소 제어 (도 1 및 2)에 상대적으로 정량화 될 수있다. 프로 IL-1β + 염색 세포의 비율은 평균 형광 강도 (MFI)를 제공하기 위해이 인구의 기하 평균을 곱합니다. MFI는 긍정적 인 염색 세포에 존재하는 프로 IL-1β의 양을 비교합니다.
다음과 같은 β-튜 블린 또는 β-액틴로 세포 내부 통제, (그림 3)에 대하여 정량화 세포 용 해물로부터 면역 블롯 대책 프로 IL-1β. nigericin 처리 된 세포에서 프로 IL-1β에 대한 면역 블롯은 프로 IL-1β의 감소를 공개해야한다. 이것은에 의.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
염증성 사이토 카인은 바이러스 감염을 싸울 타고난 및 적응 면역 반응을 스티어링에 통합되어 있습니다. 분비되는 IL-1β는 인플루엔자 감염 3, 43, 44시 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 사이토 카인이 인간의 수지상 세포에 바이러스 성 인식에 대한 응답으로 처리됩니다되는 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 골수성 DC 아이솔레이션 키트는 비용과 시간이 걸린다. 격리 키트 및 FAC 정렬 실수 수도 스트레스 또는 세포를 활성화. 또한, 실험에 대한 격리 된 세포의 부족 금액이 자주있다. 다행히, 인간 moDCs의 생물학 밀접 모델 체외 45, 46 차 인간의 골수 수지상. 두 종류의 세포가 성숙 IL-1β 분비를 달성하기 위해, 두 개의 신호, TLR은 프라이밍과 NLRP3의 활성화가 필요합니다. 따라서 moDCs가 제공하고 저렴하고 간단한 DC 모델의 세포 유형 연구하고 내기터가 인간의 건강과 질병의 NLRP3의 inflammasome을의 관.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.
감사의 글
저자는 자신의 지원과 피드백을 올리비에 Manches, 박사, Davor Frleta 박사와 메건 오브라이언, MD를 인정하고 싶습니다. 이 연구는 알레르기 및 전염병 국립 연구소에 의해 지원 및 NIH는 건강 관련 연구 (AI089030)와 RO1 (AI081848의 다양성을 촉진하기 위해 개별 Predoctoral 동호회 (F31)에 루스 L. 키르 국립 연구 봉사상을 부여 자금으로 완료되었습니다 ).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| IL-4 | R& D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | |
| RPMI 1640 | |||
| 뉴욕 혈액 센터 | PBMC는 건강한 기증자의 혈액에서 분리되었습니다 | ||
| 12 잘 조직 배양 플레이트 | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96 웰 라운드 바닥 조직 배양 플레이트 | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R& D | IC201F | |
| FITC 이소 타입 제어 | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R& D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL 멤브레인 | Millipore | IPFL00010 | |
| 구배 4-12% 폴리아크릴아미드 겔 | Bio Rad | 161-1159 | |
| Laemmli 샘플 버퍼 | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% 용액 멸균/여과 | |
| PFA | 전자 현미경 과학 | 15710 | 16% 해결책 |
| 인간 염증성 사이토카인 비드 어레이 키트 | BD | 551811 | |
| Nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| β-메르캅토에탄올 | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | 현장 재고실 | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225 cm2, 필터 캡, 70ml 작업 용량, 30/Cs | Thermo 과학 | 159933 | |
| 20 μ M 멸균 일회용 필터 유닛 | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| Goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| Donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein | ladder Thermo Scientific | 26634 | |
| 트리스 글리신 SDS 10x | 바이오 라드 | 1610732 | |
| 트리스 글리신 10x | 바이오 라드 | 161-0734 | |
| 메탄올 - 4 L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| 8 챔버 폴리스티렌 용기 조직 배양 처리 유리 슬라이드 | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
참고문헌
- Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
- Thomas, P. G., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
