Molecular signalering gjennom både østrogen og microRNAs er kritiske i brystkreft utvikling og vekst. Østrogen aktiverer østrogenreseptorer, som er transkripsjonsfaktorer. Mange transkripsjonsfaktorer kan regulere ekspresjon av microRNAs og østrogenregulert microRNAs kan profileres ved hjelp av forskjellig store teknikker.
Østrogen spiller viktige roller i melkekjertlene utvikling og brystkreft progresjon. Det formidler sin funksjon ved å binde seg til og aktivere østrogenreseptorer (ER), ERα og ERβ. ERα er hyppig oppregulert ved brystkreft og driver spredning av brystkreftceller. De grunnleggende kravene fungere som transkripsjonsfaktorer og regulere genuttrykket. Mens ERα regulering av protein-kodende gener er godt etablert, er dens regulering av noncoding mikroRNA (miRNA) mindre utforsket. mirnas spille en viktig rolle i den post-transcriptional regulering av gener, hemme deres oversettelse eller nedverdigende deres mRNA. mirnas kan fungere som onkogener eller tumor suppressors og lover også biomarkører. Blant de miRNA analyser tilgjengelig, har microarray og kvantitativ real-time PCR (qPCR) vært mye brukt for å påvise og kvantifisere miRNA nivåer. Å identifisere mirnas regulert av østrogen signalering i brystkreft, their uttrykk i ERα-positive brystkreft cellelinjer ble sammenlignet før og etter østrogen-aktivering ved hjelp av både μParaflo-microfluidic mikromatriser og Dual merkede prober-low density arrays. Resultatene ble validert ved hjelp av bestemte qPCR analyser, anvende både Cyanine dye-basert og Dual merkede prober basert kjemi. Videre ble en tid-punkt-analyse for å identifisere regler over tid. Fordeler av miRNA analysen tilnærmingen som brukes i denne studien er at det muliggjør en rask screening av modne miRNA forskrifter i mange prøver, selv med begrensede prøvemengder. Oppsettet, herunder de spesifikke vilkår for cellekultur og østrogenbehandling, biologiske og tekniske gjentak, og storskala screening etterfulgt av bekreftelser i dybden ved hjelp av separate teknikker, sikrer en robust deteksjon av miRNA forskrifter, og eliminerer falske positiver og andre gjenstander. Men, muterte eller ukjente mirnas, eller forskrifter på barne og forløper transkripsjon level, vil det ikke bli detektert. Metoden som presenteres her representerer en grundig undersøkelse av østrogen-mediert miRNA regulering.
Østrogen er et hormon som er viktig under melkekjertlene utvikling. Østrogen spiller også viktige roller i utviklingen, vedlikehold, risiko og behandling av brystkreft en. Østrogen utøver sin funksjon ved å binde seg til ende kravene, som er transkripsjonsfaktorer og regulerer spesifikke målgener. Av de to reseptor-variantene, er ERα avgjørende for østrogen-avhengige proliferasjon av brystkreftceller. De fleste brystkrefttilfeller er ERα-positive og avhenger av østrogen for vekst. Dette har gjort østrogensignalisering og ERα et mål for behandling av hormon-reseptor positiv brystkreft. Forstå den underliggende mekanismen for ERα er viktig for å bedre behandlingsresultatene, overvinne motstand mot behandling, og forstå hvordan brystkreft utvikler seg.
mirnas spiller avgjørende roller i cellefunksjoner på grunn av deres store utslag i post-transcriptional genregulering. mirnas er 19-24 nukleotider kort, single-strandet, Kodende RNA som er første transkribert av RNA polymerase II inn i primære miRNA transkripsjoner (pri-miRNA). De er behandlet i kjernen av drosha i korte-hårnål forløper-mirnas (pre-miRNA) og deretter behandlet av Dicer og delt opp i ett og ett hårstrå til å danne modne miRNAs i cytoplasma. Singelen-strandet modne miRNAs overføres til Argonaute proteiner for å danne RISC-komplekset. Deretter kan de miRNAs hybridisere til 3'-utranslaterte regioner (3'-UTR) av et mål-mRNA, som fører til post-transkripsjonell regulering ved å blokkere oversettelse eller nedbryte mål mRNA 2..
På grunn av den viktige rollen som både østrogen og miRNAs spiller i tumorprogresjon, identifisere miRNAs forbundet med normal eller avbrutt østrogensignalisering er viktig for å øke vår forståelse av utviklingen og forbedre behandlingen av bryst-cancer. Selv om det er en god forståelse av hvordan ERα regulerer protein-kodende gener, utvidelseog detaljer om kodende RNA regelverket gjenstår å bli grundig undersøkt. Innledende studier tar sikte på å belyse ERα regulering av miRNA i brystkreft cellelinjer har gitt motstridende resultater, selv når den samme cellelinje har blitt analysert 3-6. Dette kan være et resultat av forskjellige behandlinger, biologiske variasjoner, bruk av forskjellige teknikker, og det faktum at den lille størrelsen på miRNAs gjør dem vanskelig å analysere. Her er en protokoll som styrer for variasjoner og metode gjenstander beskrevet.
For å identifisere hvilke mirnas er regulert av østrogen, er profilering av en veldefinert brystkreft modell av ERα aktivitet et første skritt. Flere cellelinjer har blitt generert fra humane ERα-positiv brystkreft svulster, som er avhengig av østrogen ligner på de fleste kliniske brystkreft. De molekylære egenskaper av to av disse cellelinjer, T47D og MCF7, inkludert ekspresjonen av ERα og dets nedstrøms mål,progesteron hormon reseptor (PR), mangel på uttrykk av membran reseptor HER2, sammen med uttrykk av østrogen-responsiv og luminal-epitelial differensiering gener, gjør dem egnet som modeller for luminal subtype av brystsvulster 7-10. 17β-østradiol (E2) er den dominerende form for østrogen, og konsentrasjonene og tidspunkter for optimal transcriptional aktivering av ERα har vært preget i flere studier. I denne protokoll 10 nM E2 behandling for 24 timer er brukt og T47D og MCF7 som modeller for ERα aktivitet i brystkreftceller en. I tillegg kan tidsavhengige miRNA forskrifter være spesielt analyseres i et tidsintervall på for eksempel 1-72 timer.
For det andre har å analysere miRNA separate utfordringer, delvis på grunn av deres korte størrelser. miRNAs ikke er godt bevart i den totale RNA-preparat ved vanlige guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA-presipiteringer blir utført, eller når stAndard kolonne renselser er brukt. Spesielle forholdsregler må tas for å opprettholde eller berike for den mindre fraksjonen av RNA. Ved å øke volumet av isopropanol, senke temperaturen før sentrifugering (-80 ° C), og utelatelse av vasking i 70% etanol, kan holde av miRNAs forsterkes ved utfelling. Alternativt kan spesifikke kolonner og buffere for en høy kvalitet og robust fremstilling av miRNA holdige total RNA brukes. Også for analysen selv, sine korte størrelser skaper utfordringer. For genome-wide miRNA screening, er det tre vanlige miRNA profilering teknikker å velge mellom: Mikromatriser, qPCR, og neste generasjons sekvensering. Hver teknikk kan utføres ved hjelp av flere ulike plattformer, og ulike prøve forberedelser er nødvendig, hver med ulik risiko for å introdusere gjenstander. I miRNA microarray, er et lysbilde flekket eller syntetisert med tusenvis av oligonukleotider. Disse oligonukleotider er brukt som prober, og hver av sondens er utformet for å hybridisere til en bestemt miRNA sekvens. Den prøveopparbeidelse for mikromatriser, som utføres i denne studien, beriker først for mirnas og introduserer Cy5 og Cy3 merking på de miRNAs da. Microarray gir mulighet til å observere de relative ekspresjonsnivåer av et stort antall gener som samtidig er rask og egnet for screening av store antall prøver, men bare kan analysere sekvensene tilstede i microarray, og vil for eksempel ikke oppdage endringer i ukjente eller mutert mirnas. Microarray analyse som utføres i denne protokollen krever også relativt store mengder, ca 5 mikrogram, av total RNA per prøve for analyse. Lav tetthet qPCR miRNA profilering krever mindre materiale (700 ng / prøve og replikere), og gjør det mulig for påvisning og kvantifisering av miRNAs. Transkripsjon nivåer kan bestemmes, og mengden kan være et absolutt beløp eller en relativ mengde. qPCR analyser første krever konvertering av miRNA inn cDNA, her ved hjelp et bøydprimer for hver spesifikke miRNA sikrer analyse av bare modne miRNA. Dette genererer en lengre mal som kan forsterkes benytte en miRNA spesifikk forover primer og en universal revers primer komplementær til den løkkesekvens, og kan havnen inkluderingen av en dobbelt merket probe for spesifisitet. qPCR kan brukes i en lav-tetthet-format hvor hundrevis av miRNAs kan påvises i parallell ved hjelp av en eller flere 384-brønns plater med individuelle primerpar i hver brønn 11.. Neste generasjon sekvensering, på den annen side, er den eneste av disse teknikker som gjør det mulig for oppdagelsen av nye, mutert eller redigerte miRNAs, ettersom alle RNA i en prøve kan bli sekvensert 11.. Denne teknikken krever imidlertid flere trinn for å berike små RNA og produsere et lite RNA-bibliotek ved hjelp av flere trinn av linkerligeringer og rensinger med påfølgende forbedret risiko for å modulere deres relative ekspresjonsnivåer mellom prøvene. Det krever også betydelige bioinformatics analyse. Gitt de ulike teknikker for miRNA profilering, avhenger det mest hensiktsmessig teknikk på søknadene. Mikromatriser er mest egnet når materialet er relativt rikelig, og interessen er å definere differensial uttrykk for allerede kjente miRNAs. Lav tetthet qPCR arrays er mest egnet når en begrenset mengde prøve er tilgjengelig, og en høy følsomhet av lavt uttrykt miRNAs er nødvendig. Sekvensering egner seg best når analyse av ukjente miRNAs, muterte eller forskjellige isoformer av en miRNA er nødvendig.
I studiet av østrogenregulert miRNAs i brystkreft, er to modell celler linjer benyttes, T47D og MCF7, hvor store mengder av RNA er lett tilgjengelige. Hver celle linjen ble analysert i replikert cellekulturer ved hjelp av ulike passasjer, hver i tekniske replikat av behandling. Dette gjør det mulig for robust deteksjon av reproduserbart, ERα-regulerte mirnas. Relative miRNA uttrykk nivåer ble sammenliknet med både miRNA microarray ogDual merkede prober – low density arrays (DLP-LDA) og validert resultatene med spesifikke qPCR bruker både Cyanine fargestoff og DLP kjemi. miRNA forskrifter ble deretter videre analysert i tidsserier for å definere nøyaktig regulering over tid, noe som kan bidra til å skille tilfeldige eller biologiske variasjoner fra østrogen-indusert forskrifter, og indikerer primære effekter fra sekundære effekter. Bioinformatical sammenligninger med kromatin-bindende studier av ERα kan ytterligere hjelp i differensieringen av primær versus sekundære effekter. Analysen resulterte i en pålitelig vurdering av miRNA regelverk der det kunne bli etablert at etter 24 timers E2 behandling protein-koding transkripsjoner lett ble regulert, men modne miRNAs ble ikke påvirket en. Det er imidlertid mulig at miRNAs reguleres ved senere tids-punkter, som vist i tidsserieanalyse av utvalgte miRNAs en. Detaljene må bli ytterligere utforsket og protokollen presenteres her gir en Robust måte å studere hormonell regulering av modne miRNAs i brystkreftcellelinjer.
Bestemme mekanisme for hormonell regulering av miRNA i brystkreftceller kan gi en plattform for å forstå denne sykdommen og kan gi potensiell behandling for brystkreft. Dyrking av disse cellene for å gi den optimale betingelse for hormon handling er meget viktig. Her har en protokoll som sikrer at hormonet av interesse (østrogen) ble ekskludert før behandling, og at en optimal dose av E2 ble anvendt etter en passende tid i løpet av behandlingen er blitt beskrevet. Andre hormonelle og vekstfaktoreffekter ble holdt på et minimum ved å gradvis senke serumnivåene og ved hjelp av DCC-FBS, som er FBS som er blitt strippet for mesteparten av sitt hormon, cytokiner og vekstfaktorer. Fenolrødt-fritt medium ble videre brukt for å minimalisere andre nonhormonal effekter, gitt at fenolrødt er blitt rapportert å ha østrogen aktivitet og påvirke visse funksjoner i cellelinjer 20,21. Tiden for eksponering av cellene til hormonet er av stor viktighet. For østrogen-assosiert regulering av gener, har det tidligere blitt vist at 24-hrexposure produsere signifikant respons av direkte målgener i brystkreftceller 1,18. Siden miRNAs er transkribert ved RNA polymerase II, slik som mRNA, kan det tenkes at dette er et egnet tidspunkt for å detektere direkte regulering også av miRNAs. Det er ennå ikke bestemt om og hvordan disse miRNAs påvirker uttrykket av disse kjente ER mål i brystkreftceller.
miRNA uttrykk profilering kan være utfordrende på grunn av den relativt lille størrelsen på miRNA, at det modne miRNA sekvensen kan finnes også i det pri-miRNA og pre-miRNA, og på grunn av heterogeniteten i deres GC-innhold 22. Flere profilering teknikker og kjemi har vært ansatt for å overvinne disse problemene. Blant disse er ulike tilnærminger av microarray og qPCR analyse (figur 2). Selv microarray er allment akseptert for hele genomet analysis, kan det gi falske negative og det eksisterer forskjeller mellom de tilgjengelige plattformer, alt fra kjemien til utskriftsteknologi 23. Også normalisering prosessen presenterer en utfordring når analysere de relativt få miRNA gener, som telles i tusener i forhold til de titusenvis av mRNA transkripsjoner. qPCR, på den annen side, er mer følsom, og er bedre i bruk når færre gener som skal vurderes. Imidlertid, når utført i store 384-brønns plater, med bare en teknisk replikere per plate, flere plater må analyseres for hver prøve som gjør analysen kostbare. Også i våre hender, ble mange flere falske negative resultater oppnådd ved bruk av DLP-LDA analyse i forhold til microarray. Gitt at den modne miRNA sekvensen er til stede i den pri-miRNA og de pre-miRNA sekvenser, er det av interesse å skille mellom disse transkripsjoner bruker PCR teknikker 24. DLP sonder er tilgjengelig også for pre-miRNAs, og specific primere kan også være designet for å utelukke annen moden eller forløper varianter bruker Cyanine fargestoff qPCR teknologi.
qPCR er en gylden standard for validering av differensial uttrykk fra profilering resultater. Effektiviteten av qPCR imidlertid er avhengig av flere parametere inkludert RNA ekstraksjon, RNA integritet (kvalitet), cDNA-syntese, primer utforming, deteksjonsmetode (kjemi), og referanse-genet for data normalisering 1,22,25. Alternativene til primer design for miRNA analyse er meget begrenset, ettersom den korte miRNA sekvenslengde ikke gir rom for mye alternativ primer konstruksjon, og bare én primer kan det inneholdes i denne korte sekvens. Derfor er det behov for alternative manipulasjoner som illustrert i figur 2. Tekniske replikater er viktig for å validere robusthet amplifikasjonsmetoden og prosessen som anvendes. Biologiske replikater er nødvendig for en representasjon av den generelle biologiske variation, inkludert variable respons på ligand-behandling, og for å vise at effekten sett i en celle er reproduserbare. Basert på vår erfaring, kan variasjoner i miRNA uttrykk mellom cellekulturer oppstår. Vanligvis er disse forskjellene er mindre enn 1,3 ganger, og gjennomsnittet av verdier og tilsvarende SD identifiserer naturlig og teknisk variant. Denne variasjon kan skyldes forskjellige faktorer, inkludert, celletettheten, og det faktum at celle-funksjoner kan endres fra passasje til passasje. Å identifisere statistisk signifikante uttrykk som følge av ligand behandling, er en allment akseptert betydning når p-verdien er mindre enn 0,05. Her har en student t-test på de biologiske og tekniske gjentak med den tosidige fordelingen og to-utvalgs ulik varians parametere blitt brukt. Andre t-testparametere eksisterer, og valget avhenger av eksperimentelle oppsettet 26.
En detaljert protokoll i å vurdere hormonelle regler i modne MirNA i brystkreft celler har blitt gitt. Viktige teknologier og kjemi i profilering og validere disse miRNA uttrykk har blitt tydelig forklart. Teknologien som er valgt for studier av miRNA i brystkreftceller slutt avhenger av hva som blir etterforsket.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til Dr. Xiaolian Gao, University of Houston, for å gi råd til LC Sciences miRNA microarray plattform, til Dr. Karin Edvardsson, Karolinska Institute, Sverige, og Dr. Eylem Aydogdu, University of Houston, for å dele sine miRNA kompetanse . Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award Antall R01CA172437. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health. Dette arbeidet ble også støttet med tilskudd fra Texas Emerging Technology Fund under avtalen no. 300-9-1958.
DMEM | Life Technologies | 11885092 |
F12 | Life Technologies | 11765054 |
FBS | Sigma-Aldrich | F0926-500ML |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 |
phenol red-free DMEM | Life Technologies | 11054020 |
Ultrapure Water | EMD Millipore | Specific equipment |
DCC-FBS | Sigma-Aldrich | F6765-500ML |
100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 |
PBS tablet | Medicago, Accurate chemicals | Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100) |
17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
ICI 182,780 | Sigma-Aldrich | I4409 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-600ML |
T47D or MCF7 cells lines | American Type Culture Collection (ATCC) | T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22) |
T-75 flask | VWR International LLC | BD353136 (vented cap) |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300062 |
Serological pipet | VWR International LLC | 53300. For 5mL (53300-421) |
Countess Cell Counting chamber | Life Technologies | C10228 |
Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | C10227 |
100 mm plates | VWR International LLC | 25382-166 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) | Life Technologies | 15596026 |
Rubber cell scraper | VWR International LLC | 82050-470 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) | Qiagen | 217004 |
Rnase-Free DNase I kit (DNA degradation) | Qiagen | 79254 |
RNase-free water (Nuclease-free water) | Thermoscientific | SH30538.02 |
Nanodrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-1000 |
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit | Agilent | 5067-1512 |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C and for software (G2946) |
All primers (except TaqMan primers) | Integrated DNA Technologies | Specific per order for each gene/miRNA |
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit) | Life Technologies | 18080085 |
MicroAmp Fast 96-Well reaction plate | Life Technologies | 4346906 |
Fast Optical Adhesive Covers | Life Technologies | 4311971 |
2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) | Life Technologies | 4385612 |
7500 Fast Real-Time PCR System and software | Life Technologies | 4351106 |
μParaflo Microfluidic Biochip Technology | LCSciences | MRA-1001 and AS-2001(for result analysis) |
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) | Life Technologies | 4400928 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit | Life Technologies | 4366596 |
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler | Life Technologies | 4310899 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG | Life Technologies | 4324018 |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 |
SDS and RQ manager softwares | Life Technologies | 4444202 |
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit | Life Technologies | MIRC-50 |
10X DPL (TaqMan) RT primers | Life Technologies | Specific for each miRNA |
20X DPL (TaqMan) real-time assay primer | Life Technologies | Specific for each miRNA |