Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em> In vitro</em> Modello di Corsa
Summary
Abbiamo sviluppato un modello fetta cervello che può essere usato per esaminare meccanismi molecolari coinvolti nel trauma cranico eccitotossicità mediata. Questa tecnica genera tessuto cerebrale maturo vitale e riduce il numero di animali necessari per la sperimentazione, pur mantenendo la circuiteria neuronale, interazioni cellulari e compartimenti post-sinaptici in parte intatto.
Abstract
Esaminare i meccanismi molecolari coinvolti in condizioni neuropatologici, come l'ictus ischemico, può essere difficile quando si utilizzano sistemi animali interi. Come 'neuronale, come i «sistemi di coltura di cellule tale, primaria o vengono comunemente utilizzati. Mentre questi sistemi sono relativamente facili da lavorare, e sono sistemi modello utile in cui diversi esiti funzionali (come la morte cellulare) può essere facilmente quantificato, i risultati esaminati e percorsi nei neuroni immaturi coltura (come vie di morte cellulare eccitotossicità mediata) non sono necessariamente uguali a quelli osservati nel cervello maturo, o in tessuto intatto. Pertanto, vi è la necessità di sviluppare modelli in cui meccanismi cellulari nel tessuto neurale maturo può essere esaminato. Abbiamo sviluppato una tecnica in vitro che può essere usato per studiare una varietà di vie molecolari nel tessuto nervoso intatto. La tecnica descritta qui utilizza tessuti di ratto corticale, ma questa tecnica può essere adattato per usare tessutoda una varietà di specie (come topo, coniglio, cavia, e pollo) o regioni cerebrali (ad esempio, ippocampo, striato, ecc). Inoltre, una varietà di stimoli / trattamenti può essere utilizzato (ad esempio, eccitotossico, somministrazione di inibitori, ecc). In conclusione, il modello fetta cervello qui descritto può essere usato per esaminare una serie di meccanismi molecolari coinvolti nel trauma cranico eccitotossicità mediata.
Introduction
La forma più comune di ictus è ictus ischemico, che si verifica quando un vaso sanguigno cerebrale diventa occlusa. L'ischemia del tessuto risultante dalla cessazione del flusso sanguigno provoca diffusa depolarizzazione delle membrane, rilascio di neurotrasmettitori eccitatori, e aumento prolungato del calcio intracellulare, che porta all'attivazione di morte cellulare Percorsi di 1. Questo processo è stato definito 'eccitotossicità', ed è un percorso comune coinvolto nella morte neuronale prodotta da una varietà di patologie, compreso il colpo 2. Inibizione delle vie di segnalazione coinvolte nella excitotoxicity e altre cascate di morte delle cellule neuronali è un approccio interessante per limitare i danni neuronali dopo l'ictus.
Identificare i meccanismi molecolari precisi coinvolti nella excitotoxicity e ictus ischemico può essere difficile quando si utilizzano sistemi animali interi. Come tale, embrionale primario e 'neuronale-like' (ad es neuroblastomacchine e linee di adenocarcinoma immortalati) sistemi di colture cellulari vengono spesso utilizzati. I principali vantaggi di questi modelli sono che sono facili da manipolare, relativamente conveniente, e morte cellulare possono essere facilmente misurati e quantificati. Tuttavia, vie di segnalazione possono essere modificati dalle condizioni di coltura utilizzate 3,4, ei neuroni immaturi e immortalati linee possono esprimere i recettori diversi e molecole di segnalazione rispetto a maturare cervello 5-8. Inoltre, neuroni in coltura consentono solo l'esame di un tipo di cellula (o due, se viene usato un sistema di co-coltura), mentre il tessuto cerebrale intatto è eterogenea, contenente una varietà di tipi di cellule che interagiscono tra loro. Sistemi di coltura organotipica fetta (espianti sottili di tessuto cerebrale) sono anche utilizzati, e questi modelli permettono lo studio delle popolazioni eterogenee di cellule come si trovano in vivo. Tuttavia, solo una quantità limitata di tessuto può essere ottenuto da ciascun animale quando si utilizza questa tecnica, fette puònon essere in coltura a lungo come linee cellulari immortalizzate e medio coltura a lungo termine può provocare alterazioni in vie di segnalazione e recettori nelle fette. Mentre cervello maturo può essere utilizzato per generare fette organotipiche, fette di cervello immaturo sono più suscettibili alla cultura, e sono più comunemente utilizzati. Vi è quindi la necessità di sviluppare modelli che mimano o rappresentano intatta cervello maturo, che sono facili da usare, in cui vie di segnalazione neuronali possono essere esaminate.
Qui, una tecnica in vitro che coinvolge il tessuto nervoso intatto che può essere utilizzato per chiarire i meccanismi molecolari coinvolti nella morte delle cellule dopo un insulto ischemico o eccitotossico è descritto. Questa tecnica riduce il numero di animali necessari per eseguire un esperimento, è riproducibile, e genera tessuto vitale che si comporta in modo simile a metabolicamente più grandi fette organotipiche. Inoltre, la circuiteria neuronale, interazioni cellulari, e co postsinapticompartment rimane parzialmente intatta. Il buffer fisiologico utilizzati consente alle membrane cellulari per 'reseal', e permette alle cellule di recuperare la loro resistenza membrana originale 9. Questo modello fetta cervello è in grado di imitare fedelmente risposte osservate a seguito di eccitotossicità mediata da lesioni cerebrali di 10, e può essere utilizzato per esaminare i meccanismi molecolari coinvolti nella corsa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, una tecnica in vitro per la generazione di microslices che possono essere utilizzati per esaminare i meccanismi molecolari coinvolti nella eccitotossicità e morte cellulare mediata da ischemia in tessuto cerebrale maturo intatto è descritto. Questa tecnica produce tessuti vitali (figure 1-3), che è metabolicamente simile a grandi fette organotipiche 15. Inoltre, questo modello microslice corrisponde strettamente alla risposta osservata dopo eccitotossicità mediata da lesioni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di ricerca dalla Salute e medicina Consiglio Nazionale delle Ricerche of Australia, Hunter Medical Research Institute, e l'Università di Newcastle.
Materials
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | Used to generate 100-400 μm brain sections. | ||
| McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | |||
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3. r. d., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H. Practical Neurochemistry. , (1975).
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
