Выражение, изоляция, и очистка растворимых и нерастворимых Биотинилированные белков для нервной ткани Регенерация

Summary

Разработка biotinylatable слитые белки имеет много потенциальных применений в различных областях исследований. Рекомбинантный инженерно белок является прямым процедура, которая является экономически эффективным, обеспечивая высокие урожаи специально разработанных белков.

Abstract

Рекомбинантный инженерно белок используется кишечной палочки (E.coli) системы экспрессии на протяжении почти 4 десятилетия, а сегодня Е. палочка по-прежнему наиболее широко используется организмом-хозяином. Гибкость системы позволяет добавлением фрагментов, таких как биотин тега (для стрептавидином взаимодействий) и больших функциональных белков, как зеленый флуоресцентного белка или вишнево-красного белка. Кроме того, интеграция неестественных аминокислот, таких как ионов металлов хелаторов, однозначно активных функциональных групп, спектроскопических зондов, и молекул, придающих пост-трансляционные модификации позволило лучше манипулирование свойствами белковых и функциональных возможностей. В результате этот метод создает настраиваемые слитые белки, которые предлагают значительные утилиту для различных областях исследований. Более конкретно, biotinylatable последовательность белка были включены в многих белков-мишеней вследствие высокой аффинности взаимодействия между биотина с авидином и стрептавидином. Это дополнение помог в повышении обнаружения и очистки меченых белков, а также открывая путь для вторичных приложений, таких как сортировки клеток. Таким образом, биотин-меченых молекул показать все большую и широкую влияние в Биоиндастриэл и биомедицинских областях. Для целей нашего исследования мы разработали рекомбинантных белков биотинилированное слияния, содержащие фактор роста нервов (ФРН) и semaphorin3A (Sema3A) функциональные области. Мы сообщали ранее, как эти белки слияния биотинилированный, вместе с другими активными белковых последовательностей, могут быть привязаны к биоматериалов для тканевой инженерии и регенеративной целей. Этот протокол описывает основы инженерной biotinylatable белков в масштабе миллиграмм, используя Т7 лаковые индуцибельную вектор и E. палочки хозяева выражения, начиная с преобразования масштабирования и очистки.

Introduction

Белки охватывают широкий диапазон биомолекул, которые отвечают за многих биологических функций, в конечном счете, приводит к правильного формирования тканей и организации. Эти молекулы инициировать тысячи путей, которые контролируют до регулирования и / или понижающей регуляции генов и других белков сигнализации, поддержания равновесия в человеческом теле. Срыв одного белка влияет весь этот веб сигналов, что может привести к возникновению разрушительных расстройств или заболеваний. Инженерно отдельные белки в лаборатории предлагает одно решение для борьбы с этими отрицательных последствий и предлагает альтернативу низкомолекулярных препаратов. В 1977 году, ген, кодирующий последовательность соматостатина 14 аминокислот был одним из первых инженерных полипептидов, созданных с помощью E. палочка ^1. Вскоре после того как в 1979 году, инсулин был клонирован в плазмиду pBR322, трансформируется, выразил, и очищенный ^2. С тех пор, рекомбинантные белки расширили свое влияние на несколько областей реснить поиск таких как биоматериалов, доставки лекарств, тканевой инженерии, биофармацевтических препаратов, сельского хозяйства, промышленных ферментов, биотоплива и т.д. (по отзывам см. ссылки ^3-8). Это в значительной степени из-за гибкости, что метод предлагает через добавлением специализированных химических фрагментов или белковых последовательностей для целей, включая, но не ограничиваясь этим, идентификации целевой белок, стабилизации и очистки.

Через технологии рекомбинантной ДНК, рекомбинантные белки могут быть экспрессированы в различных эукариотов и прокариотов хост-системы, включая млекопитающих, растений, насекомых, дрожжей, грибков или бактерий. Каждый хост предлагает различные преимущества и, как правило, лучшие системы определяется на основе функции белка, выход, стабильность, общей стоимости и масштабируемость. Бактерии клетки часто не хватает посттрансляционные механизмы модификации, что эукариотические хозяева предоставляют (т.е. гликозилирования дисульфид мостов, E TC.) ^5. В результате млекопитающих и насекомых системы обычно приводит к лучшей совместимости и экспрессии эукариотических белков, однако эти узлы, как правило, дороже и отнимает много времени ^9. Таким образом, Е. палочка является благоприятствования хост для нашей системы экспрессии, поскольку клетки быстро расширяться в недорогих условий роста и генетические механизмы экспрессии хорошо понимал ^5,9. Кроме того, эта система легко масштабируется вверх для производственных целей и результатов в функциональных белков, несмотря на отсутствие пост-трансляционных модификаций ^10. Е. Штамм E.coli К12 выбирается в этом протоколе для клонирования, поскольку этот штамм предлагает прекрасные урожаи плазмиды на основе высокой эффективностью преобразования. Кроме того, Е. штамм BL21 используется для выражения, потому что эту гостиницу штамм содержит РНК ген полимеразы Т7, которая обеспечивает контролируемое экспрессию белка и стабильности ^11.

палатка "> После выбора узла, далее следует соблюдать осторожность при выборе идеального вектора экспрессии, чтобы облегчить выбирают и регулируют экспрессию белка. Синтез рекомбинантных белков начинается с целевой последовательностью ДНК, которая клонирована в соответствии с направлением транскрипции бактериофага Т7 и сигналов перевода, и экспрессия индуцируется в клетках-хозяевах, содержащих хромосомные копии гена РНК-полимеразы Т7 ^12. Эти векторы, полученные из плазмидного вектора pBR322 (для обзора см. ссылку ^13), которые под жестким контролем промотора T7 первоначально разработанного Studier и его коллеги ¹⁴ и обеспечивают дополнительное контроль путем включения оператора ЛАК и лаковые репрессор (lac1) ^15,16. Для рекомбинантного белка техники, эта система выражение дает возможность адаптировать конкретную аминокислотную последовательность желаемого белка путем вставки различные последовательности ДНК-мишени или создать слитые белки состоит из комбинированного областис с одного белков. Кроме того, некоторые векторные серии включают пептидные изменения тегов, которые будут размещены на N или С-конца. Для наших целей дизайна, гистидин (His) был добавлен к последовательности-мишени ДНК для очистки и biotinylatable последовательность 15 аминокислоты были включены для биотинилирования ^17,18. В этом протоколе плазмиду, содержащую ген устойчивости к ампициллину, была выбрана, чтобы нести наши белковые последовательности biotinylatable синтеза. Выражение управляется в этом векторе через Лак промотора Т7 и легко индуцировали изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG).

Тестовые выражения (мелкомасштабные культур) используются для определения присутствия и растворимость белка-мишени, что может быть выражено либо в растворимой или нерастворимой форме, чтобы сформулировать процедуры очистки. Растворимый белок выразил в бактерий клетки будут испытывать спонтанное сворачивание сохранить свою нативную структуру ^19. Обычно роднойструктура термодинамически выгодным. Во многих случаях метаболическая активность хозяина не способствует белка-мишени, оказывает давление на систему, что приводит к нерастворимого продукции белка и образованием телец включения, состоящие из нерастворимых белковых агрегатов. Таким образом, целевой белок денатурирует, что делает их, как правило биологически неактивными ^20. Оба теста выражения в увеличенном масштабе, и процедуры выделения определяются растворимости белка-мишени. Дополнительным ренатурация или шаг повторной укладки требуется для нерастворимых белков. Полученные рекомбинантные белки могут быть дополнительно очищен с помощью эксклюзионной хроматографии.

В доме рекомбинантного белка предлагает экономически преимуществ по сравнению с коммерческими продуктами, так как миллиграммов белка-мишени, могут быть выделены на литр основной культуры. Большая часть необходимого оборудования имеется в типичной биологической или химической лаборатории. Белковая инженерия позволяет создаватьпользовательских слитых белков с добавлением функций, которые не всегда имеются в продаже. Рисунок 1 показаны основные процедуры, связанные с инженерно рекомбинантных белков. С помощью этой системы экспрессии мы создали множество biotinylatable белки, такие как интерферон-гамма, тромбоцитарный фактор роста и костного морфогенетического ^{белка-21-23,} но мы будем сосредоточить внимание на двух белков, которые мы предназначенных для аксонов, NGF (29 кДа ) и Sema3A (91 кДа) ¹⁰ (для обзора см. ссылку ^24). Биотинилирование является общим методом для идентификации, иммобилизации и изоляции меченых белков с использованием известного биотин-стрептавидин взаимодействие ^25-27. Биофизические зонды ^28,29, биосенсоры ^30, и квантовые точки ³¹ приведены некоторые примеры систем, которые используют высокое сродство биотин-стрептавидин сопряжения с _Уб на порядка 10 ^-15 М ^27. Е. палочка биоолово лигазы, Бира, помогает в ковалентного биотина в боковой цепи лизина, находящегося в этом биотина последовательность ^18,32 помечены. Модем биотин к материалам и биомолекул выпустила задержанную доставку факторов роста в ячейку для нескольких тканевой инженерии ^21,33-35. Поэтому, машиностроение эти специально разработанных biotinylatable белки является мощным инструментом, который может превзойти несколько научных интересов.

Protocol

1. Проектирование белок-мишень Использование Национальный центр биотехнологической информации веб-сайта (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) получить аминокислотную последовательность для белка-мишени с учетом видов интереса и любых вариантах сплайсинга. Выбор аминокислотную последовательност?…

Representative Results

Клонирование и испытаний Выражение Когда покрытие выполняется должным образом, одной изолированной колонии должны сформировать увеличить шансы выщипывание клональная трансформированные клетки бактерий (рис. 2а). Однако, если слишком много клетки…

Discussion

Рекомбинантный инженерно белок является очень мощная техника, которая охватывает множество дисциплин. Он является экономически эффективным, перестраиваемый и относительно простая процедура, что позволяет производство высокими выходами специально разработанных белков. Важно отмет?…

Materials

1,4-dithio–DL-threitol, DTT, 99.5%	Chem-Impex International	127	100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol	Chem-Impex International	642	250 ml
Acetic acid, glacial	EMD	AX0073-9	2.5 L
Agar	Bioshop	AGR001.500	500 g
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518	25 g
Antifoam 204	Sigma-Aldrich	A6426	500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
BL21(DE3) Competent Cells	Novagen	69450	1 ml; Expression Host
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916	500 ml
BugBuster	Novagen	70922-3	100 ml
Gel filtration standard	Bio-Rad	151-1901	6 vials
Glycerol	Bioshop	GLY001.1	1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride	Chem-Impex International	152	1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88222	100 ml
Hydrochloric acid	EMD	HX0603-3	2.5 L
Imidazole	Chem-Impex International	418	250 g
IPTG	Chem-Impex International	194	100 g
Laemmli sample buffer	Bio-Rad	161-0737	30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface	Chem-Impex International	270	500 g
LB Broth	Sigma-Aldrich	L3022	1 kg
NovaBlue Competent Cells	Novagen	69825	1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK	10 pack
Potassium Chloride	Chem-Impex International	01247	1 kg
Sema3A-pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	1 L
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	1 kg
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-500	500 g
Sodium phosphate diabasic	Sigma-Aldrich	S5136-500G	500 g
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	500 g
Terrific Broth	Bioshop	TER409.5	5 kg
Tetracycline hydrochloride	Chem-Impex International	667	25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X	Bio-Rad	1610732	1 L
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	1 kg
Tryptone, pancreatic	EMD	1.07213.1000	1 kg
Yeast extract, granulated	EMD	1.03753.0500	500 g
Name of Kits/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
ÄKTApurifier10	GE Healthcare	28-4062-64	Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000	MAXQ 4000
BirA500	Avidity	BirA500	Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette	Thermo Scientific	66380	Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing	Spectrum Laboratories	132127, 132129	MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923	GE Healthcare	11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit	Invitrogen	1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C	GE Healthcare	18-6083-13
Fraction Collector Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00	Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator	VWR	13271-102	Model 1156D
Heating Oven FD Series	Binder		Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg	GE Healthcare	17-1069-01	Discontinued–Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge	Beckman Coulter	393126
JA 25.50 Rotor	Beckman Coulter	363055
JLA 8.1 Rotor	Beckman Coulter	969329	Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor	Beckman Coulter	368690
Laminar Flow Hood	Themo Scientific	1849	Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader	TECAN		infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8004	4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels	Bio-Rad	456-9036	Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column	Bio-Rad	737-2512	49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit	OMEGA bio-tek	D6943-01
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	164-5052	250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes	VWR	3119-0050	50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators	Corning	431488, 431483	20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service	GenScript USA Inc.		Protein Services
Ultrasonic Processor	Cole-Parmer	18910445A	Model CV18
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560