DNBS / TNBS التهاب القولون نماذج: توفير نظرة ثاقبة مرض التهاب الأمعاء وآثار الدهون الغذائية
Summary
DNBS / TNBS التهاب القولون الناجم يقدم بديلا وسيلة غير مكلفة لدراسة البيولوجيا المرضية لمرض التهاب الامعاء. بروتوكول مناقشتها في هذه الورقة الخطوط العريضة للتطبيق الناجح لDNBS للحث على التهاب القولون في الفئران والجرذان ويسمح احد لدراسة وافية الردود الأمعاء بوساطة المضيف.
Abstract
لطالما ارتبط أمراض التهابات الأمعاء (IBD)، بما في ذلك مرض كرون والتهاب القولون التقرحي، مع الأساس الجيني، واستضافة المزيد من الاستجابات المناعية مؤخرا إلى العوامل الميكروبية والبيئية. التهاب القولون ثنائي نتروبنزين حمض السلفونيك (DNBS) التي يسببها يسمح احد لدراسة التسبب في IBD المسببات البيئية المرتبطة بها مثل الإجهاد والنظام الغذائي، وآثار العلاجات المحتملة، والآليات الكامنة وراء التهاب الأمعاء والمخاطية إصابة. في هذه الورقة، ونحن التحقيق آثار الأحماض N-3 و n-6 الدهنية الغذائية على الاستجابة الالتهابية المخاطية القولون التهاب القولون لDNBS التي يسببها في الفئران. تم تغذية الفئران حمية جميع متطابقة مع استثناء من أنواع مختلفة من الأحماض الدهنية [زيت القرطم (SO)، وزيت الكانولا (CO)، أو زيت السمك (FO)] لمدة ثلاثة أسابيع قبل التعرض لDNBS داخل المستقيم. استمرت السيطرة الفئران أعطيت الايثانول داخل المستقيم اكتساب الوزن على مدى 5 أيام الدراسة، في حين والجرذان DNBS المعاملة حمية الدهون تغذية جميع لوسر الوزن مع FO وCO تغذية الفئران مما يدل على فقدان وزن كبير قبل 48 ساعة والفئران التي تغذت SO قبل 72 ساعة. استأنفت زيادة الوزن بعد 72 DNBS آخر ساعة، وبنسبة 5 DNBS أيام آخر، وكان مجموعة FO على وزن أعلى من SO أو مجموعات CO. جمعت أقسام القولون أظهرت 5 أيام آخر DNBS معالجة تقرح التنسيق، وتدمير سرداب، واستنفاد الخلايا الكأسية، والغشاء المخاطي تسلل كل من الخلايا الالتهابية الحادة والمزمنة التي تختلف في شدتها بين الجماعات النظام الغذائي. أظهرت مجموعة تغذية SO الضرر أشد تليها CO، وFO تغذية الجماعات التي أظهرت أخف درجة من إصابة الأنسجة. وبالمثل، كان الميلوبيروكسيداز القولون (MPO) النشاط علامة على النشاط العدلة أعلى بكثير في ذلك وتتبعه الفئران CO فدان، مع وجود FO الفئران التي تغذت أقل بكثير النشاط MPO. هذه النتائج تثبت استخدام DNBS التي يسببها التهاب القولون، على النحو المبين في هذا البروتوكول، لتحديد تأثير النظام الغذائي في التسبب في مرض التهاب الأمعاء.
Introduction
يتميز مرض التهاب الأمعاء (IBD) عن الالتهاب المزمن الناكس في المعدة والأمعاء (GI) المسالك، مما أدى إلى أعراض الإسهال، وفقدان الوزن، وألم في البطن. التهاب القولون التقرحي (UC) ومرض كرون (CD) هما أشكال رئيسية من مرض التهاب الأمعاء، ويمكن تمييزها عن طريق موقع التهاب في الجهاز الهضمي. في المرضى UC، الالتهاب عادة ما ينطوي على المستقيم وتمتد متاخم يصل القولون لحد متغير تؤثر فقط على الغشاء المخاطي السطحي. في المقابل، يمكن أن تؤثر على CD أي جزء من الجهاز الهضمي، على الرغم من أنه يؤثر في الغالب على الدقاق والأعور. يظهر CD كثيرا ما التهاب بطريق غالبا ما ترتبط مع حبيبية ويؤدي إلى stricturing (fibrostenotic) و / أو اختراق (fistulizing) المرض. على الرغم من أن مسببات مرض التهاب الأمعاء لا يزال بعيد المنال، ومن المتفق عليه أيضا أن IBD هو سياقاتها، التي تنطوي على تفاعلات بين المضيفين الجهاز المناعي، والقابلية الوراثية المسؤولةسيس إلى العوامل البيئية والجرثومية.
حتى الآن، تم اقتراح نماذج مختلفة من IBD التي تعرض مختلف الاستجابات السريرية والنسيجية والمناعية سمة من جامعة كاليفورنيا وCD. وتشمل النماذج الأكثر شيوعا الفئران المعدلة وراثيا (IL-2، IL-10، SAMP / تطلب الشركة)، والعدوى النماذج التي يسببها (الليمونية rodentium، السالمونيلا التيفية الفأرية)، ونماذج نقل بالتبني (CD45 + RB عالية، ونقل الخلايا CD62L + في الفئران SCID) و نماذج التهاب القولون يسببها كيميائيا (ديكستران كبريتات الصوديوم (DSS)، Trinitrobenzene حامض السلفونيك (TNBS)، وثنائي نتروبنزين حامض السلفونيك (DNBS)). نظرا لانخفاض تكلفتها وسرعة ظهور المرض، وتعتبر النماذج الكيميائية لا تقدر بثمن لدراسة مختلف جوانب IBD. كل من نماذج التهاب القولون مادة كيميائية مدرجة مزاياه فضلا عن القيود في بعض الجوانب ذات الأهمية السريرية، والمناعية والأنسجة لبنك التنمية بين الامريكتين. مفاجآت صيف دبي هي واحدة من الطرق الكيميائية الأكثر شيوعا المستخدمة للحث على القولونيةتيس في القوارض 1. إدارة 3-10٪ DSS (MW: 42 كيلو دالتون) لمدة 7-10 أيام في مياه الشرب من الفئران يمكن أن تحدث أعراض وعلامات التهاب القولون بما في ذلك فقدان الوزن والاسهال والدم، تقصير القولون، تقرح المخاطية والعدلة التسلل. هذا النموذج هو مفيدة بشكل خاص للدراسات فحص المخدرات، فضلا عن استكشاف آليات التجديد الظهارية، وتأثير المناعة الفطرية في المخاطية التوازن، ودور الالتهاب في تعزيز النمو الشاذ المعوية والتنمية غدية. ولكن هناك بعض السلبيات لنموذج مفاجآت صيف دبي، بما في ذلك الاختلاف في تركيز DSS اللازمة للحث على التهاب القولون في مرافق حيوانية مختلفة، فضلا عن امتصاص المياه غير متناسقة من قبل الفئران وبالتالي التعرض لمفاجآت صيف دبي تتعارض، مما أدى إلى تفاوت في درجة ومدى و توزيع إصابة الغشاء المخاطي وتقرحات في القولون. كل هذه الميزات يؤدي إلى عدم تجانس النتائج والحد من القدرة على مقارنة النتائج عبر دراسات الابام مجموعات بحثية مختلفة.
بديلا للنموذج مفاجآت صيف دبي هو DNBS التي يسببها ناشبة أو نماذج TNBS من التهاب القولون. هذا النموذج يستخدم تقطير المستقيم من المخاطية توعية وكلاء DNBS أو TNBS، مخففة في تركيزات متفاوتة من الايثانول. إدارة الإيثانول هو شرط أساسي لكسر حاجز الغشاء المخاطي للقولون للسماح تغلغل DNBS أو TNBS في الصفيحة المخصوصة. سوف DNBS / TNBS ثم haptenize القولون والأمعاء الميكروبي البروتينات المترجمة لتصبح مناعة، مما اثار المضيف الفطرية والاستجابات المناعية التكيفية. بشكل عام، ويرتبط هذا النموذج مع الإسهال الشديد والدموي أحيانا، وفقدان الوزن وسماكة جدار الأمعاء ولكن الأعراض تختلف تبعا لنوع من القوارض المستخدمة، وكذلك توقيت والجرعة ودرجة التعرض إلى DNBS أو TNBS المستخدمة في الدراسة. وتجدر الإشارة إلى الفروق المهمة بين الفئران والجرذان، مع فوائد أقل تكلفة للشراء والمجلس، وكذلك لويص كتلة الجسم لتقليل لكل حيوان تكاليف العلاج في الجسم الحي. هذا يجب تعيين ضد مسار أكثر سرعة وشديدا من التهاب القولون في الفئران، حيث الحيوانات أكثر هشاشة وتستجيب بسرعة قد تصل إلى نقطة نهاية إنسانية.
التهاب الأمعاء النتائج في البداية من الإيثانول الناجم عن تلف الخلايا الظهارية في الأمعاء، مما يؤدي إلى زيادة نفاذية الظهارية، والاختراق الميكروبية في الغشاء المخاطي، haptenization من البروتينات المضيف، كل هذا أدى إلى تسلل العدلات، الضامة والخلايا اللمفية تي الاستجابة Th1 في الغشاء المخاطي للتلف. بالمقارنة مع DNBS، ويعتبر TNBS كمادة كيميائية خطرة نظرا لخصائص التأكسدي للغاية لأنه يمكن أن تشكل خطر الانفجار على اتصال مع القواعد مثل الصوديوم وهيدروكسيد البوتاسيوم. لذا يعتبر DNBS حاليا كخيار يفضل الكيميائية على TNBS للحث على التهاب القولون. في القوارض، ويعتبر التهاب القولون DNBS باعتبارها واحدة من الأساليب الأكثر ملاءمة لدراسة فولو فوتبال شيIBD الجناح المرتبطة معدلات المرض:
- الاكتئاب وتنشيط التهاب القولون: ولقد ثبت أن التوتر والقلق والاكتئاب في المرضى الذين يعانون IBD وكثيرا ما يرتبط مع انتكاس المرض. DNBS التهاب القولون هو نموذج مناسب لدراسة دور الاكتئاب وآثاره على تنشيط التهاب القولون في الفئران. طريقة الاستقراء الأولي عادة ما ينطوي على التهاب القولون بواسطة DNBS، يليه قرار من التهاب القولون من خلال ترك الفئران لمدة 6-8 أسابيع. ثم تدار الفئران مع الاكتئاب العوامل المسببة مثل ريزيربين أو عن طريق حاسة الشم bulbectomy للحث على الاكتئاب يليه اختبار لهم لتنشيط التهاب القولون من خلال التحدي مع جرعة من subcolitic DNBS 2.
- التوتر وتنشيط التهاب القولون: الإجهاد هو عامل بيئي آخر شائع التي تم ربطها إلى IBD المرضية. هناك مجموعة متزايدة من الأدلة التي تشير إلى وجود علاقة قوية بين التوتر المزمن وظهور الأعراض من جامعة كاليفورنيا وCD في القوارضق وكذلك في البشر والرئيسيات غير البشرية 3. DNBS التهاب القولون هو نموذج جيد لدراسة تفعيل المرتبطة الإجهاد التهاب القولون في كل من الفئران والجرذان. وعادة ما يتم استخدام طريقة بطريقة مماثلة على النحو المذكور أعلاه لعلاج الاكتئاب إلا في مكان والاكتئاب، وتتعرض الحيوانات لعوامل الإجهاد مثل الصوت وضبط النفس الإجهاد 4.
- التهاب العصبية: وقد وصف عدد من الدراسات إما تعديلات عابرة أو دائمة في الجهاز العصبي المعوي (ENS) البنية والوظيفة، كما رأينا في عينات الأنسجة من النماذج الحيوانية ومن المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء. DNBS هو نموذج جيد لاستكشاف آثار التهاب على ENS 5 ودراسة كل من نورأدريني والمسارات العصبية كوليني 6.
- آليات إصابة إصلاح: خلال IBD المرضية، كلها قد أظهرت المستمدة من المضيفة وسطاء إصابة مثل أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، وأكسيد النيتريك (NO)، بين الخلايا جزيء التصاق 3 (ICAM-3)، وف selectin عيكمن دور في تعطيل الظهارية في الأمعاء. DNBS هو نموذج ممتاز لدراسة الإصابات الناجمة عن تنظيم ما يصل من هذه الوسطاء فضلا عن آليات الإصلاح التي يتم تنظيمها باستخدام أدوية مثبطات انتقائية أو 7،8.
- التهاب بطريق: بالإضافة إلى التطبيقات المذكورة أعلاه من DNBS، ونموذج يمكن أن تطبق أيضا على دراسة الالتهابات بطريق للامعاء، وميزة الكلاسيكية وجدت في المرضى الذين يعانون من CD. وترتبط كل من DNBS والتهاب القولون TNBS التي يسببها مع تسلل كبيرة من الخلايا الليمفاوية، في الغشاء المخاطي للقولون مما يجعل هذه النماذج مفيدة بشكل خاص لدراسة خلايا T المناعية آليات التابعة.
بالمقارنة مع النموذج مفاجآت صيف دبي، ومزايا DNBS والتهاب القولون TNBS التي يسببها تشمل منخفضة التكلفة، والتطور السريع للالتهاب القولون (وعادة ما يتطلب 1-3 أيام لتظهر تقرحات والتهاب استنساخه) والضرر المترجمة متسقة إلى القولون البعيدة. ولكن السلبيات هي شرط لمستوى أعلى من الخبرة التقنية، والتحسين من جرعة DNBS / TNBS، والحاجة للتخدير لإدارة المستقيم.
في هذه الورقة المنهجية درسنا آثار تركيزات مختلفة من ن 6 و n-3 الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة على تغيير استجابة القولون المخاطي لالتهاب القولون DNBS التي يسببها في الفئران باستخدام الزيوت النباتية زيت القرطم (SO) وزيت الكانولا (CO) ، وزيت السمك (FO). وقد تبين أن الأحماض N-6 و n-3 الدهنية وسطاء هاما من مرض التهاب الأمعاء من خلال دورها في الأنصاف أسيل من phosopholipids غشاء الخلية 9. وعلى النقيض من المحتمل proinflammatory ن 6 والأحماض الدهنية، ن 3 الدهنية في تناول جرعات عالية بما فيه الكفاية يمكن أن تكون الأدوية المضادة للالتهابات. يتم بوساطة الإجراءات المضادة للالتهابات ن 3 الدهنية مباشرة من خلال استبدال حمض الأراكيدونيك باعتبارها الركيزة eicosanoid، تثبيط استقلاب حمض الأراكيدونيك وبشكل غير مباشر من خلال تغيير proinflالتعبير الجيني ammatory وإشارة الخلية. الأحماض الدهنية ن 3 أيضا إلى نشوء resolvins، وهي عائلة من الوسطاء المضادة للالتهابات. ويرتبط تناول كميات كبيرة من ن 3 الأحماض الدهنية مع انخفاض في إنتاج eicosanoids proinflammatory، السيتوكينات، كيموكينات، أنواع الاكسجين التفاعلية والتعبير عن جزيئات الالتصاق. في هذه الدراسة، تم تغذية الفئران حمية بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية متطابقة في جميع العناصر الغذائية ما عدا الأحماض الدهنية، مع كطاقة في المئة من الدهون، 20٪ SO، 20٪ CO، أو 18٪ زيت السمك بالاضافة الى 2٪ زيت القرطم (FO) 10-11 . كنسبة مئوية من الطاقة يوميا، شريطة النظام الغذائي SO 15٪ حمض اللينوليك (LA)، مع <0.06٪ α حمض اللينولينيك (ALA)، وحمض الدهني لا (EPA) أو حمض الدوكوساهيكسانويك (DHA)، وكان النظام الغذائي CO 4.2 LA٪ و 1.9٪ مع عدم وجود ALA EPA DHA أو، والنظام الغذائي FO قدمت وكالة حماية البيئة 1.4٪، 4.9٪ DHA، 0.32٪ LA، و 0.12٪ ALA. بعد ثلاثة أسابيع من بدء النظام الغذائي الدهون، كانت تدار على الفئران DNBS داخل المستقيم أو 50٪ من الإيثانول وضحى بعد 5 أيام. وinflتم تقييم استجابة ammatory عن طريق تقييم من فقدان الوزن، وعشرات الضرر النسيجي والأنسجة النشاط الميلوبيروكسيداز.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج DNBS الموصوفة في هذا البروتوكول هو قيمة وغير مكلفة، وقابلة للتكرار نموذج التهاب القولون التي يمكن استخدامها لدراسة مختلف جوانب IBD. عندما تدار intrarectally للفئران أو الفئران، DNBS الحث على درجة كبيرة من الالتهابات وإصابات الأنسجة في القولون، تشبه مرض كرون الإنسان من حي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة العاملة لKJ من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) وكرون والتهاب القولون مؤسسة من كندا (CCFC). ويدعم VM من قبل الزمالة CFRI وGB على studentship خريج من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR). BAV هو الأطفال الذين يعانون من اضطرابات المعوية والكبد مؤسسة (الطفل) رئيسا للأطفال IBD البحوث وكرسي أبحاث كندا في الجهاز الهضمي للأطفال وKJ هو أحد كبار العلماء الطبيب بدعم من الطفل والطفل ومعهد بحوث العائلة (CFRI) برنامج الطبيب جائزة العلماء ، جامعة كولومبيا البريطانية.
Materials
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 gauge needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intra-rectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intra-rectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| O-dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BIORAD | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | San Diego California USA, www.graphpad.com |
References
- Perše, M., Cerar, A., Biotechnol, J. .. . B. i. o. m. e. d. . Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. , (2012).
- Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Deng, Y., Verdu, E., Khan, W., Collins, S. Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse model of depression. Gastroenterology. 136 (7), 2280-2288 (2009).
- Reber, S. Stress and animal models of inflammatory bowel disease-an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Psychoneuroendocrinology. 37 (1), 1-19 (2012).
- Qiu, B., Vallance, B., Blennerhassett, P., Collins, S. The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility of mice to stress-induced reactivation of experimental colitis. Nat. Med. 5 (10), 1178-1182 (1999).
- Boyer, L., et al. Myenteric plexus injury and apoptosis in experimental colitis. Auto. Neurosci. Basic Clin. 117 (1), 41-53 (2005).
- Saunders, P., et al. Noradrenergic and cholinergic neural pathways mediate stress-induced reactivation of colitis in the rat. Auto. Neurosci. Basic Clin. 124 (1-2), 56-68 (2006).
- Cuzzocrea, S., et al. Calpain inhibitor I reduces colon injury caused by dinitrobenzene sulphonic acid in the rat. Gut. 48 (4), 478-488 (2001).
- Cuzzocrea, S., et al. Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. J. Pineal Res. 30 (1), 1-12 (2001).
- Innis, S., Jacobson, K. Dietary lipids in early development and intestinal inflammatory disease. Nutr. Rev. 65, S188-S193 (2007).
- Innis, S. M., de La Presa Owens, S. Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain. J. Nutr. 131 (1), 118-122 (2001).
- Jacobson, K. Mundra H.,Innis S.M. Intestinal responsiveness to experimental colitis in young rats is altered by maternal diet. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289, 13-20 (2005).
- Sanovic, S., Lamb, D. P., Blennerhassett, M. G. Damage to the enteric nervous system in experimentalcolitis. Am. J. Pathol. 155 (4), 1051-107 (1999).
- Vilaseca, J., Salas, A., Guarner, F., Rodriguez, R., Martinez, M., Malagelada, J. R. Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis. Gut. 31, 539-544 (1990).
- Andoh, A., Tsujikawa, T., Ishizuka, I., Araki, Y., Sasaki, M., Koyama, S., Fujiyama, Y. N-3 fatty acid-rich diet prevents early response of interleukin-6 elevation in trinitrobenzene sulfonic acid-induced enteritis. Int. J. Mol. Med. 12, 721-725 (2003).
- Barros, K. V., Xavier, R. A., Abreu, G. G., Martinez, C. A., Ribeiro, M. L., Gambero, A., Carvalho, P. O., Nascimento, C. M., Silveira, V. L. Soybean and fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis. Lipids Health Dis. 9, 68 (2010).
- Hekmatdoost, A., Wu, X., Morampudi, V., Innis, S. M., Jacobson, K. Dietary oils modify the host immune response and colonic tissue damage following Citrobacter rodentium infection in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (10), 917-928 (2013).
- Innis, S. M., Dai, C., Wu, X., Buchan, A. M., Jacobson, K. Perinatal lipid nutrition alters early intestinal development and programs the response to experimental colitis in young adult rats. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299 (6), 1376-1385 (1152).
