DNBS / TNBS колит Модели: Предоставление взглянуть на воспалительное заболевание кишечника и эффекты диетического жира
Summary
DNBS / TNBS индуцированной колит предлагает альтернативу и недорогой метод для изучения патобиологии воспалительного заболевания кишечника. Протокол рассматриваются в настоящем документе излагаются успешное применение DNBS чтобы вызвать колит у мышей и крыс и позволяет тщательно изучить хост-опосредованной кишечные реакции.
Abstract
Воспалительные заболевания кишечника (IBD), в том числе болезни Крона и язвенный колит, уже давно ассоциируется с генетической основе, а в последнее время иммунного ответа к микробным и факторов окружающей среды. Динитробензол кислоту (DNBS)-индуцированной колит позволяет изучать патогенез IBD связанных экологических триггеров, таких как стресс и питание, последствий потенциальных методов лечения, а также механизмов, лежащих воспаление кишечника и повреждения слизистой. В данной работе мы исследовали эффекты биологически активных н-3 и н-6 жирных кислот на толстой слизистой воспалительного ответа на DNBS-индуцированного колита у крыс. Все крыс кормили идентичные диет за исключением различных типов жирных кислот [сафлоровое масло (SO), масло канолы (CO), или рыбий жир (FO)] в течение трех недель перед воздействием Интраректальное DNBS. Контрольные крысы, приведенные интраректального этанола продолжали набирать вес в течение 5-дневного исследования, в то время как, DNBS-обработанных крыс кормили липидов диеты все Losт вес с FO и СО кормили крыс демонстрируя значительную потерю веса на 48 ч и крыс кормили SO на 72 часа. Увеличение веса возобновлена после 72 часов после DNBS, и на 5 дней сообщению DNBS, группа FO имели более высокий вес тела, чем SO или CO группы. Кишечное разделы собраны 5 дней после DNBS обращения показал фокусное язвы, склеп разрушение, истощение кубок клеток и слизистой оболочки проникновение как острых, так и хронических воспалительных клеток, отличающихся по степени тяжести среди диетических групп. ТАК подается группа показала самый серьезный ущерб, за которой следует CO, и FO кормили группы, которые показали самый мягкий степень повреждения тканей. Точно так же, толстой миелопероксидаза (МРО), маркера активности нейтрофилов была значительно выше в SO последующим СО кормили крыс, с FO кормили крыс, имеющих значительно более низкую активность MPO. Эти результаты показывают, использование DNBS-индуцированного колита, как указано в этом протоколе, чтобы определить влияние диеты в патогенезе IBD.
Introduction
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) характеризуется хроническим воспалением рецидивирующего в желудочно-кишечный тракта (ЖКТ), в результате чего симптомы диареи, потеря веса, и боли в животе. Язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD) являются двумя основными формами IBD, и можно отличить по месту нахождения воспаления в желудочно-кишечном тракте. У пациентов UC, воспаление обычно включает в себя прямую кишку и простирается непрерывно до толстой кишки для разной степени влияющих только поверхностное слизистую оболочку. В противоположность этому, компакт-диск может повлиять на любую часть желудочно-кишечного тракта, хотя это преимущественно поражает подвздошной кишки и слепой кишки. CD часто проявляется как трансмуральный воспаление часто связано с гранулем и приводит к сужение (fibrostenotic) и / или (проникающий) fistulizing заболевание. Хотя этиология IBD остается неуловимым, он хорошо принято считать, что IBD является многофакторной, включая взаимодействия между хозяевами иммунную систему, генетической предрасположенности и несет ответственностьSES экологических и микробных факторов.
На сегодняшний день различные модели IBD были предложены, что отображать различные клинические, гистологические и иммунные реакции, характерные для UC и CD. Наиболее часто используемые модели включают генетически модифицированных мышей (IL-2, IL-10, SAMP / YIT), инфекции, вызванные моделей (Citrobacter rodentium, сальмонелла Typhimurium), усыновители модели перевод (CD45 + РБ Высокие, передачи сотового CD62L + в SCID мышей) и химически индуцированные модели колит (декстран сульфат натрия (DSS), тринитробензолсульфоновой кислота (ТНБ), и Динитробензол сульфокислоты (DNBS)). Благодаря их низкой стоимости и быстрого начала заболевания, химические модели считаются бесценными для изучения различных аспектов IBD. Каждый из химических моделей колит перечисленных имеет свои преимущества, а также недостатки в некоторых аспектах их клинического, иммунологического и гистологической отношение к IBD. DSS является одним из наиболее распространенных методов, используемых химических индуцировать палочкитис у грызунов 1. Введение 3-10% DSS (MW: 42 кДа) в течение 7-10 дней в питьевой воде мышей может вызывать симптомы и признаки колита в том числе потеря веса, понос с кровью, толстой укорочения, слизистой оболочки язв и инфильтрации нейтрофилов. Эта модель особенно полезна для скрининга лекарственных средств исследований, а также изучения механизмов регенерации эпителия, влияние врожденного иммунитета на слизистой гомеостаза, а также роль воспаления в продвижении кишечника дисплазии и развития аденокарциномы. Существуют, однако, некоторые недостатки модели DSS, в том числе изменения в концентрации DSS, необходимой, чтобы вызвать колит в различных объектов животного, а также поглощения противоречивы воды по мышей и, таким образом, несовместимым воздействия DSS, в результате чего изменения в степени, степени и распределение поражения слизистой и язв в толстой кишке. Все эти особенности приводят к неоднородности результатов и ограничить возможность сравнить результаты различных исследований фрOM различные исследовательские группы.
Альтернативой модели DSS является гаптен-индуцированной DNBS или TNBS модели колита. Эта модель использует прямой кишки инстилляцию слизистой сенсибилизации агенты DNBS или TNBS, разбавленного в различных концентрациях этанола. Администрация этанола является необходимым условием, чтобы сломать барьер слизистой оболочки толстой, чтобы позволить проникновение DNBS или TNBS в собственной пластинке. DNBS / TNBS будет haptenize локализованные толстой и кишки микробные белки стать иммуногенны, тем самым вызывая хозяина врожденного и адаптивного иммунного ответа. В общем, эта модель связана с тяжелой и иногда кровавый понос, потеря веса и желудочно-кишечном утолщение стенки однако симптомы варьируются в зависимости от типа используемого грызунов, а также сроков, дозы и степени воздействия на DNBS или TNBS используется в Исследование. Важные различия между крысами и мышами Следует отметить, с преимуществами низкой стоимости на покупку и питание, а также Лоуг массы тела для уменьшения на-животного расходы на лечение в естественных условиях. Это должно быть установлено против более быстрого и тяжелого течения колита у мышей, где более хрупкие и чувствительные животные могут быстро добраться до гуманного конечную точку.
Воспаление кишечника первоначально приводит из этанола, индуцированной повреждением эпителиальных клеток кишечника, что приводит к увеличению проницаемости эпителия, микробного проникновения в слизистую оболочку, haptenization принимающих белков, все это приводит к инфильтрации нейтрофилов, макрофагов и Т-лимфоцитов Th1 в поврежденную слизистую оболочку. По сравнению с DNBS, TNBS рассматривается как опасного химического вещества в связи с его высокой окислительной свойств, которые могут представлять опасность взрыва при контакте с основаниями, такими как натрий и гидроксида калия. Поэтому DNBS в настоящее время рассматривается в качестве предпочтительного выбора химических над TNBS индуцировать колит. У грызунов, DNBS колит рассматривается как один из самых удобных способов для изучения FOLLOкрыло IBD связано модификаторы болезни:
- Депрессия и реактивация колита: Было показано, что стресс, беспокойство и депрессия у пациентов с IBD часто связаны с рецидива заболевания. DNBS колит является подходящей моделью для изучения роли депрессии и ее последствий на реактивации колита у мышей. Метод обычно включает первоначальный индукцию колита по DNBS, а затем постановлением колит, оставив мышей в течение 6-8 недель. Затем мышей вводили с депрессией в результате чего агентов, таких как резерпин или обонятельной bulbectomy, чтобы вызвать депрессию с последующим их тестирования для реактивации колита через вызов с subcolitic дозе DNBS 2.
- Стресс и реактивация колита: Стресс является еще одним распространенным экологический фактор, что было связано с IBD патогенеза. Существует все больше доказательств, что предполагает тесную связь между хроническим стрессом и появления симптомов UC и CD в грызунас, а также у человека и приматов 3. DNBS колит является хорошей моделью для изучения стресса связаны реактивации колита у мышей и крыс. Метод обычно используется таким же образом, как указано выше, за исключением депрессии вместо депрессии, животные подвергаются воздействию стрессовых таких как звуковых и удерживающей стресса 4.
- Нейрогенного воспаления: Ряд исследований описали либо переходные или постоянные изменения в кишечной нервной системы (ENS) структуры и функции, как видно в образцах ткани от животных моделях и от пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника. DNBS является хорошей моделью для изучения влияния воспаления на ENS 5 и изучать как норадренергическую и холинергические нервные пути 6.
- Травма-ремонтные механизмы: Во IBD патогенеза, принимающие полученных травм посредники, такие как активные формы кислорода (АФК), оксида азота (NO), межклеточной адгезии 3 (ICAM-3) и P-селектина все было показано на стр.заложить роль в кишечного эпителия нарушения. DNBS превосходная модель для изучения повреждений, вызванных положительную регуляцию этих посредников, а также механизмов репарации, которые регулируются с помощью селективных препаратов или ингибиторов 7,8.
- Трансмуральное воспаление: В дополнение к упомянутым выше применений DNBS, модель может также применяться для изучения трансмуральный воспаление кишечника, классический функцию у больных с компакт-диска. Оба DNBS и ТНБ-индуцированные колит связаны со значительным инфильтрации лимфоцитов, в слизистой оболочки толстой кишки решений эти модели особенно полезны для изучения Т-клеточные зависимые иммунные механизмы.
По сравнению с моделью DSS, преимущества и DNBS TNBS-индуцированных колита включают низкую стоимость, быстрое развитие колита (обычно требует 1-3 дней, чтобы показать воспроизводимый язвы и воспаления) и последовательного локализованное повреждение дистального отдела толстой кишки. Однако недостатки являются необходимым условием дляболее высокий уровень технических знаний, оптимизации дозы DNBS / TNBS, и потребность в анестезии для ректального введения.
В этой методологической работе изучали эффекты различных концентраций п-6 и омега-3 полиненасыщенных жирных кислот на изменения ответа толстой слизистой к DNBS-индуцированного колита у крыс с помощью растительных масел сафлоровое масло (ТАК) и рапсовое масло (СО) , и рыбий жир (FO). Было показано, что н-6 и омега-3 жирные кислоты являются важными медиаторами воспалительных заболеваний кишечника через их роли в качестве ацильными группами клеточных мембран phosopholipids 9. В отличие от провоспалительного потенциала н-6 жирных кислот, п-3 жирных кислот при достаточно высоким потреблением потенциально сильными противовоспалительными агентами. Противовоспалительные действия п-3 жирных кислот опосредованы непосредственно путем замены арахидоновой кислоты в качестве субстрата эйкозаноидов, ингибирование метаболизма арахидоновой кислоты и косвенно через изменение proinflammatory экспрессии генов и клеточной сигнализации. N-3 жирных кислот также привести к Resolvins, семейство противовоспалительных медиаторов. Высокое потребление п-3 жирных кислот связано со снижением продукции провоспалительных эйкозаноидов, цитокинов, хемокинов, активных форм кислорода и экспрессии молекул адгезии. В этом исследовании крыс кормили вволю диеты одинаковы во всех питательных веществ за исключением жирных кислот, с как процент энергии из жира, 20%, так, 20% CO, 18% или рыбий жир плюс 2% сафлорового масла (FO) 10-11 . В процентах от суточной энергии, SO диета при условии, 15% линолевой кислоты (LA), с <0,06% α-линоленовой кислоты (АЛК) и не эйкозапентаеновой кислоты (EPA) или докозагексаеновой кислоты (DHA), CO диета была 4,2 % LA и 1,9% ALA, не EPA или DHA, и диета FO условии 1,4% EPA, 4,9% DHA, 0,32% LA, и 0,12% ALA. Через три недели после начала диеты липидных мышей вводили Интраректальное DNBS или 50% этанола и умерщвляли через 5 дней. Влиянammatory ответ оценивали по оценке потери веса, оценки гистологических повреждений и тканевой активности миелопероксидазы.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNBS модель, описанная в этом протоколе является ценным, недорогой и воспроизводимый колит модель, которая может быть использована для изучения различных аспектов IBD. При введении интраректально в крыс или мышей, DNBS вызывает значительную степень воспаления и повреждения тканей в толсто?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана от операционной грантов KJ из естественных наук и инженерного исследовательского совета Канады (NSERC) и болезнь Крона и колит фонда Канады (CCFC). В.М. поддерживается CFRI стипендий и ГБ выпускник студенчества от Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR). БАВ является Дети с кишечными и заболеваний печени Фонд (РЕБЕНОК) Председатель детской IBD исследований и Канада заведующая кафедрой в детской гастроэнтерологии и KJ является старшим клиницист Ученый поддержке ребенка и ребенка и (CFRI) Программы клиницист Ученые премии Семья научно-исследовательский институт , Университет Британской Колумбии.
Materials
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 gauge needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intra-rectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intra-rectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| O-dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BIORAD | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | San Diego California USA, www.graphpad.com |
References
- Perše, M., Cerar, A., Biotechnol, J. .. . B. i. o. m. e. d. . Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. , (2012).
- Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Deng, Y., Verdu, E., Khan, W., Collins, S. Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse model of depression. Gastroenterology. 136 (7), 2280-2288 (2009).
- Reber, S. Stress and animal models of inflammatory bowel disease-an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Psychoneuroendocrinology. 37 (1), 1-19 (2012).
- Qiu, B., Vallance, B., Blennerhassett, P., Collins, S. The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility of mice to stress-induced reactivation of experimental colitis. Nat. Med. 5 (10), 1178-1182 (1999).
- Boyer, L., et al. Myenteric plexus injury and apoptosis in experimental colitis. Auto. Neurosci. Basic Clin. 117 (1), 41-53 (2005).
- Saunders, P., et al. Noradrenergic and cholinergic neural pathways mediate stress-induced reactivation of colitis in the rat. Auto. Neurosci. Basic Clin. 124 (1-2), 56-68 (2006).
- Cuzzocrea, S., et al. Calpain inhibitor I reduces colon injury caused by dinitrobenzene sulphonic acid in the rat. Gut. 48 (4), 478-488 (2001).
- Cuzzocrea, S., et al. Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. J. Pineal Res. 30 (1), 1-12 (2001).
- Innis, S., Jacobson, K. Dietary lipids in early development and intestinal inflammatory disease. Nutr. Rev. 65, S188-S193 (2007).
- Innis, S. M., de La Presa Owens, S. Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain. J. Nutr. 131 (1), 118-122 (2001).
- Jacobson, K. Mundra H.,Innis S.M. Intestinal responsiveness to experimental colitis in young rats is altered by maternal diet. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289, 13-20 (2005).
- Sanovic, S., Lamb, D. P., Blennerhassett, M. G. Damage to the enteric nervous system in experimentalcolitis. Am. J. Pathol. 155 (4), 1051-107 (1999).
- Vilaseca, J., Salas, A., Guarner, F., Rodriguez, R., Martinez, M., Malagelada, J. R. Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis. Gut. 31, 539-544 (1990).
- Andoh, A., Tsujikawa, T., Ishizuka, I., Araki, Y., Sasaki, M., Koyama, S., Fujiyama, Y. N-3 fatty acid-rich diet prevents early response of interleukin-6 elevation in trinitrobenzene sulfonic acid-induced enteritis. Int. J. Mol. Med. 12, 721-725 (2003).
- Barros, K. V., Xavier, R. A., Abreu, G. G., Martinez, C. A., Ribeiro, M. L., Gambero, A., Carvalho, P. O., Nascimento, C. M., Silveira, V. L. Soybean and fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis. Lipids Health Dis. 9, 68 (2010).
- Hekmatdoost, A., Wu, X., Morampudi, V., Innis, S. M., Jacobson, K. Dietary oils modify the host immune response and colonic tissue damage following Citrobacter rodentium infection in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (10), 917-928 (2013).
- Innis, S. M., Dai, C., Wu, X., Buchan, A. M., Jacobson, K. Perinatal lipid nutrition alters early intestinal development and programs the response to experimental colitis in young adult rats. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299 (6), 1376-1385 (1152).
