이 프로토콜은 전기 세포 기판 임피던스 감지, 세포 부착, 증식, 운동성 및 약리 및 독성 자극에 대한 세포 반응의 정량화에 부착 세포의 임피던스 스펙트럼을 기록하고 분석 할 수있는 방법을 검토합니다. 내피 세포의 투과성과 세포 – 세포 및 세포 – 기질 연락처 평가의 검출이 강조된다.
전지 셀 기판 임피던스 감지 (ECIS)가 부착 세포층 내의 셀의 동작을 정량화하는 체외 임피던스 측정 시스템이다. 이를 위해, 세포는 반대, 원형 금 전극 위에 특별한 문화 실에서 재배된다. 일정한 작은 교류 전류는 전극과 전위 걸쳐 측정 사이에인가된다. 세포막의 절연성 전극 간의 증가 된 전위의 결과로 전기 전류의 흐름 방향으로 저항을 생성. 이 방법으로 세포의 임피던스를 측정하는 것은 세포 부착, 성장, 형태, 기능 및 운동성의 자동화 연구를 할 수 있습니다. ECIS 측정 자체가 간단하고 쉽게 배울 수 있지만, 기본 이론은 복잡하고 올바른 설정과 정확한 분석 및 데이터의 해석의 선택은 자명하지 않다. 그러나, 명확한 프로토콜은 실험에서 각 단계를 설명준비, 구현 및 실험 분석에 디자인을 사용할 수 없습니다. 이 문서의 기본 측정 원리뿐만 아니라 가능한 응용 프로그램에서 실험 고려 사항, 장점과 ECIS 시스템의 제한 사항에 대해 설명합니다. 가이드는 확산 및 증식, 세포 부착의 연구를 위해 제공되고, 장벽 기능, 세포 운동성, 세포 – 세포 및 세포 – 기질 접착의 질에 관한 합류 층에있는 세포 행동의 정량화하고, 상처 치유의 정량 혈관 작용 자극에 대한 세포 반응. 대표적인 결과는 인간 미세 혈관 (MVEC) 및 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)에 근거 논의하지만, 모든 부착 성장하는 세포에 적용 할 수있다.
ΩΩΩHere 우리는 ECIS, 문화 1 부착 세포의 임피던스 스펙트럼을 측정하고 분석 할 수있는 구체적인 방법으로 알려진 전기 세포 기판 임피던스 감지를 제시한다. 이 프로토콜의 목적은 임피던스 기반의 세포 분석이 특정 유형의 사용에 일반적으로 적용 할 수있는 가이드를 제공하고 응용 프로그램의 지속적 증가의 주요 기능 중 일부에 대한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 초점은 세포 증식, 장벽 기능, 세포 접합 및 세포 운동성의 연구에있을 것입니다.
ECIS 및 생물학 관련 매개 변수의 임피던스 분광 데이터를 변환하기 위해 관련 모델을 1991 년 2 Giaever과 Keese으로 과학계에 현재의 형태로 도입 된 이후, 종종 (트랜스 봉사자의 측정을위한 시스템으로 언급 된 정확하지 않은 상피 전기 저항). 차이는 처음에 한계 보이지만,데이터 해석을 위해 중요하다. 고전 봉사자 측정의 경우, 세포는 상피 꽉 접합 또는 내피있는 adherens 접속점 (3)에 의해 지배되는 세포층의 전송 메커니즘을 특성화하기 위해 투과 필터를 재배하고 있습니다. 일반적으로, 상기 필터의 상하에 위치하는 두 개의 전극은 직류 (DC)으로 인해 발생하는 전압 강하를 측정하는 4 셀 층과 다른 두 전극 위에 유동을 적용하는데 사용된다. 전기 저항은 셀 배리어의 품질의 수치 설명을 허용 옴의 법칙을 사용하여 계산된다.
ECIS이 기본 원칙을 다음과 확장합니다. ECIS 시스템에서 세포는 특별한 세포 배양 접시의 바닥에 포함 된 반대, 원형 금 전극에 재배하고 있습니다. 배양 당 전극의 개수는 물론 변수, 애플리케이션에 의존하고 전극이 250 ㎛의 직경을 갖는 표준이며 어떤 경우에는 더 큰 대향 전극회로를 완성하는 데 사용됩니다. ECIS 대신 직류 주어진 주파수 1 μA의 일정한 교류 전류 (AC)를 사용한다. 임피던스는 전극 사이의 값 (mV의) 전압에 해당하는 변경 계산됩니다. ECIS는 티이 통해 몇 가지 장점을 가지고 있으며,이 문서에서 상세히 설명 될 것이다 주파수 의존성 세포 특성을 연구하는 주파수 범위에서 임피던스를 측정 할 수있는 가능성을 제공한다. 첫째, 복잡한 임피던스를 측정하는 것은 세포 장벽 저항과 전지 용량에 전체 임피던스를 분리 할 수 있습니다. 또, 다수의 주파수에서 데이터를 취하고 수학적 모델을 적용하여, 하나의 세포 기질 상호 작용 (기본 매트릭스에 기초 세포막의 거리) 등으로 인한 접합부 임피던스 (세포 – 세포 접촉의 압박감) 및 임피던스 구별 할 세포막 커패시턴스의 포스팅. 둘째, 세포 증식 및 세포 운동성 때문에 평가할 수있다전극들과 직접 접촉하고있다. 셋째, 기판과 전극 시야 및 위상차 현미경을 허용하기에 충분히 얇다.
임피던스 측정의 근거 : 복소 임피던스
생물 개체 (예 : 세포)의 전기 임피던스의 측정을위한 기초는 옴의 법칙, 저항 (R)과의 관계를 설명하는 기본적인 전기 기술 원리, 전류 (I)와 전기 회로에서 전압 (U)입니다 주어진 시간 (t)에서.
DC 회로에 적용 가능한 : R (t) = U (t) / I (t)
AC 시스템에서 작업 할 때, 전류 및 전압은 진폭에 차이가 있지만, 또한 위상 (φ)에서뿐만 아니라. 이제 저항은 더 이상이 관계를 설명하기에 충분하지 않습니다. 대신에, 복소 임피던스 (Z) 또는 임피던스의 대부분의 강도 (| Z |) 다시 전술 오믹 저항 플러스 리액턴스 (X)를 포함하는, 사용AC에서 sults 커패시터 전압 및 전류 (5) 사이의 위상 시프트를 구동 인덕터를 통해 흐른다.
AC 회로에 적용 가능한 : | Z (F) | = √ (R 2 + X (F) 2)
φ = 아크 탄젠트 (X / R)
그 막의 특성에 의한 세포 손상에 임피던스 측정을 수행 할 때, 세포는 저항과 커패시터의 병렬 접속으로 작용한다. 정전 용량 (C)이 셀의 분극을 발생 세포막의 절연성 이층에서 전기 캐리어의 분리를 설명하는 반면 여기서, 저항, 전류 흐름에 대한 저항을 나타낸다. 이에 X는 세포막의 용량 성 특성에 의해 지배된다.
X (F) ≈ (2 * 파이 *의 F의 *의 C 셀) -1
X는 주파수에 의존하기 때문에, 측정 주파수의 편차는 셀의 상이한 기능적 및 구조적 특성의 연구를 가능하게한다. ECIS 장치 측정 R과 X, 수 계산 모두의 | Z |, C 및 φ.
전기 등가 회로 : 임피던스 분광 전체 셀 레이어를 정량화.
셀이 전기장하게되면 이전에 설명한 바와 같이, 그것은 수동 전자 부품의 특성을 나타낸다. 이제, 대신 단일 셀의 전극 위에 성장 및 세포 배양 배지로 보충 된 셀 전체 층이 조사되는 경우, 저항과 콘덴서의 간단한 모델은 전체 전기 네트워크로 확장 될 필요가있다. 소위 등가 회로에서, 전극 / 전해질의 상호 작용을 특성화 배지 (R 메드)뿐만 아니라 커패시턴스 (C 전동식) 및 저항 (R 전동식)의 저항은 3,6 고려 될 필요가있다.
부착 성 세포 성장 층용 같은 등가 회로의 간략화, 일반 예는도 1에서 발견 될 수있다. 그러한 수학적의 장점생물학적 시스템을 설명하기 pproach 이러한 회로들은 임의로 품위 및 세포 내 소기관으로 인한 또는 세포 – 세포의 영향 (R 접합부)와 휴대 기판 유착을 구별하는 임피던스를 고려하여 예를 들면 특정 실험 질문에 조정될 수 있다는 것이다 전체 임피던스 7,8에 (R 하위). 그럼에도 모델링을위한 기준은 항상 의미 상관 관계를 허용하는 임피던스 측정 된 스펙트럼의 모든 특징을 기술하는 요소들의 최소 수를 사용하는 것.
그림 1. 부착 성장 세포의 층.) 크로스 ECIS 문화의 섹션도에 대한 ECIS 시스템 대표 등가 회로의 회로도. 세포는 감지 및 카운터 전극 위에 성장다시 배양액으로 덮여있다. 전극 락인 앰프에 접속되고, AC 신호는 정전류 소스를 만드는 1 MΩ의 저항을 통해인가된다. 자극은 어떤 시점. B) ECIS 조치 임피던스에 대한 모든 개인 기여의 합에서 문화 매체에 직접 추가 할 수 있습니다. 저항 (R 전동식)와 커패시터 (C 전동식), 또한 전기적 특성의 병렬 조합으로 제시 단순성이다 전극 / 전해질 계면에 의해 발생 배양액 (R 메드)뿐만 아니라 임피던스의 저항 병렬 저항의 연결 (R 세포) 및 커패시턴스 (C MEM)에 의해 설명 세포막 건 모두 고려되어야한다. 그것이 현재 향해 세포 투과성에 의존하기 때문에 R 전지는 변수이다. 등가 회로를 확장하고 임의로 정제 할 수있다. 예를 들어 접합부 (R 접합부) 등으로뿐만 아니라 피하 (R 하위) 저항을 회로에 추가 된 것은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
임피던스 매개 변수 및 생물학적 의미
임피던스 측정으로부터 도출이 가장 직접적인 파라미터는 저항과 셀의 정전 용량이다. 저항은 품질과 세포 장벽의 기능을 나타내며, 따라서 고려 파라와 트랜스 세포의 전류 흐름을 향해 저항을합니다. 정전 용량은 전극 범위의 전체 측정을 제공합니다. ECIS의 독특한 기능은 등가 회로의 도움과 모델링과 그 전역 매개 변수는이 문서의 뒷부분에서 논의 될 것이다 세포 – 세포 및 세포 – 기질 접착을 포함한 많은 세포의 특성에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다.
실험 conside을 : 시작하기 전에배급
측정 설정 – 설정이 몇 가지 별도의 구성 요소로 구성되어 측정 전자와 ECIS 장치, -, ECIS 배열과 선택의 세포 배양, 데이터 수집을위한 PC 또는 96 – 웰 시스템 8 어레이 홀더. 어레이 홀더 인큐베이터에 넣고 인큐베이터 외측 ECIS 디바이스에 연결되어야한다. PC는 ECIS 소프트웨어 (1.2.123.0의 2013년 2월 14일)를 탑재 ECIS 장치에 연결해야합니다.
배열 선택 – 여러 응용 프로그램을 위해 설계 ECIS 배열의 지속적으로 증가하고 다양한 있습니다. 표준 배열은 각각 (E로 표시) 1 또는 10 측정 전극, 상기 (W로 표시) 8 문화 우물로 구성되어 8W1E 및 8W10E 배열입니다. 큰 대향 전극은 회로를 완료되지만 그 임피던스는 실제 측정에서 6 본질적 무시할 수있다. 표준 8 잘 배열 홀더가 호스팅 할 수있는 두rrays, 16 문화 우물의 총 수의 결과. 금 전극은 50 nm의 두께의 절연막으로 묘사하고 광학적으로 맑은의 Lexan 폴리 카보네이트 기판 또는 인쇄 회로 기판 (PCB)을 어느 하나에 장착된다. PCB 배열은 더 강력하고 효율적인 비용. 투명 슬라이드 빛과 면역 형광 현미경을 허용. 어떤 고려되어야하는 것은 1E 어레이 셀 움직임에 의해 야기 저항 신호의 변동을 향상시키고 상처 치료 연구를 위해 필요하다는 것이다. 또한, 하나의 전극은 전기 및 광 신호의 상관 관계를 할 수 있습니다. 다중 전극 배열, 신호 인해 증가 된 측정 영역에 요철 접종하고 세포의 성장에 의해 데이터의 바이어스를 제한하고 인해 셀 신호의 치우침을 감소시키고, 측정에서 더 많은 세포를 포함하는 몇개의 전극 위에 평균화 운동. 따라서 다중 전극 배열은 세포 증식 및 장벽 형성을 연구하는데 유용하다. 옆에표준 배열 특별한 화성 (10)을 연구하는 전단 응력 (9)의 응용 프로그램에 해당하는 배열, 세포의 이동, 증식뿐만 아니라 높은 처리량 검사를위한 96 – 웰 플레이트가 있습니다. 결론적으로, 사용되는 배열은 과학적 질문 세포 유형에 크게 의존하고 선택하고 신중하게 테스트해야합니다.
측정 주파수 – RB 및 알파의 모델링 (데이터 분석 참조) 다중 주파수 측정 (MFT)가 필요합니다. 그렇지 임피던스 데이터가 더 높은 시간 해상도로 모아질 수있는 이점과 함께, 하나의 세포 유형 특정 주파수 (SFT)에 시간에 걸쳐 측정 할 수있다. 특정 세포 유형에 대해 가장 민감한 측정 주파수는 주파수 스캔에 의해 발견 될 수있다. 무 세포 및 세포 덮인 전극의 가장 큰 차이는 셀이 t를 차단 주파수이다 로그 – 로그 그래프에 주파수 대 주파수에 각각 저항 임피던스 플로팅되면그는 현재 가장 효과적으로. 내피 세포 (EC)의 경우에는이 주파수는 약 4 kHz에서입니다.
파종 밀도 – 모든 일반 세포 기반 실험 파종 밀도로는 과학적인 문제에 따라 달라집니다. 밀착성을 연구하고 확산 또는 배리어 형성하면 내피 세포 융합을 보장 / cm 2 40,000-60,000 세포를 고밀도로 48 시간 후에 안정 배리어를 시딩한다. 실험의 초점은 증식에 있으면, 내피 세포 / cm이 약 2000 ~ 10000 세포의 저밀도로 시딩한다.
ECIS는 셀 속성과 행동의 심사뿐만 아니라 알려진 알 수없는 물질의 효과를 정량화를위한 훌륭한 도구입니다. 이에 세포가 표준 배양 조건에서 유지되며, 임피던스는 연속적으로 높은 시간 해상도로 모니터링하고 광 신호에 상관 될 수있다. 그 방법은 셀의 조작을위한 최적 시점은 형태 학적 및 기능적 셀 상태에 기초하여 선택 될 수있다. 불행하게도, 이러한 높은 측정 해상도는 온도, pH 또는 세포의 기계적 자극 (중간 변경)의 작은 변화가 즉시 임피던스 신호에 영향을 미칠 것 가격으로 제공됩니다.
세포에 작은 측정 전류의 응용 프로그램은 ECIS 측정은 비 침습적 비파괴 및 레이블이없는 만들지 만, 결과적으로 패시브 생체 전기 특성 (더 활동 전위)를 측정 할 수 없습니다. 주요 기능은 매개 변수의 수 데르 수 있다는 것입니다 투과성 또는 상처 치유 분석법 같은 여러 고전 분석법로부터 정보를 결합, 단일 측정으로부터 ived. 여기에서 특히 흥미로운 점은 수학적으로 모델링 된 데이터가 저항 및 정전 용량의 변화를 탐구하고 서로 다른 세포 구조 (예를 들면 세포 연락처 또는 세포막)로를 참조하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 주의하는 것이 중요 임피던스 분광은 항상 하나의 세포에 대한 연구를 허용하고 또한 수학적 모델이 합류 세포층 만 유효하지 않습니다 감지 전극의 모든 세포에서 평균 신호를 제공하는 것입니다. 따라서 내피 세포는 이전에 성숙한 세포 유착과 정지 세포를 확인하기 위해 모델링에 사용되는 적어도 하루에 합류 상태로 유지되어야한다. 마찬가지로, 전기 상처는 최적의 상흔 효율을 달성하고 전극의 손상을 방지하기 위하여, 높은 주파수를 가진 다수의 상흔 짧은 펄스를 사용하는 셀 층을 컨 플루 언트하기 위해 적용되어야한다.
jove_content "> 모든 분석에서, 이러한 각각의 세포 유형에 대한 어레이 기판, 코팅 및 파종 밀도의 조합과 같은 몇 가지 매개 변수를 실험하기 전에 테스트 및 최적화 할 필요에 따라, ECIS 측정에서 정보의 최대 양을 얻을 수 있습니다.ECIS의 가장 큰 한계는 측정이 분자 수준에서 직접 정보를 제공하지 않는다는 것입니다. 따라서 ECIS 측정은 세포 구조 나 특성을 가진 과학적인 문제를 연결하는 데 도움이하고 검증 가능한 가설의 생성에 중요한 입력을 제공하는 실험 시리즈의 시작 부분에 일반적으로 대부분의 정보를합니다. 따라서 ECIS의 모듈 형 설계는 맞춤 옷 배열에 대한 가능성과 응용 프로그램의 다양한 스펙트럼을 제공합니다. 최신 배열의 개발은 세포 증식 및 전기 남긴 상처에 대한 높은 처리량 임피던스 검사에 대한 미래의 초점과 생체의 시뮬레이션을위한 특별한 흐름 배열의 사전을 나타냅니다 </eM> 다른 흐름 프로파일과 전단 응력.
또한 문학
또한 애플리케이션 노트, 웹 세미나 및 전체 ECIS 스펙트럼을 다루는 출판물의 자세한 목록은 응용 생물 물리학의 웹 페이지 (www.biophysics.com)를 참조하십시오.
The authors have nothing to disclose.
저자는 자신의 조언을 찰스 박사 Keese 박사 기독교 Renken, 기독교 Dehnert (응용 생물 물리학 주) 박사 울프 위 Radler (ibidi GmbH에) 감사 도움이 원고를 준비하는 동안 유익한 토론 것이다. 또한 우리는 자신의 우수한 기술 지원을 위해 얀 반 Bezu에게 감사의 말씀을 전합니다.