입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

요약

입자 추적 microrheology은 비파괴 정량 및 공간적 차원 종양 모델에서 세포 외 기질 (extracellular matrix) 기계적 성질의 변화를 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

기계 미세 자체가 리모델링 복잡한 양방향 mechanosensitive 상호 작용의 한 부분으로서 수정 종양의 성장 동작 및 신호의 중요한 규칙, 역할을 보여왔다. 생물학적으로 중요한 3D 종양 모델의 개발은 종양 성장에 대한 매트릭스의 레올 로지에 미치는 영향에 대한 역학적 연구를 촉진하고 있지만, 종양에 의해 유도 된 기계적 환경 매핑 변화의 역 문제는 도전 남아있다. 여기, 우리는 종 방향으로 현장에서, 종양 미세 환경의 물리적 변화를 모니터링하기위한 강력하고 실행 가능한 접근 방법의 일환으로 췌장암의 3D 모델과 함께 입자 추적 microrheology은 (PTM)의 구현을 설명합니다. 여기에 설명 된 방법론과 형광 표지 프로브가 균일하게 포 배포 모델 세포 외 기질 I 콜라겐 유형의 (ECM) 지지체에 포함 체외 3D 모델을 준비하는 시스템 통합구성비와 표본 전체에 시간에 따른 microrheology은 측정. 체외 종양 도금 및 멀티 웰 이미징 플레이트를 사용하여 병렬 상태에서 조사됩니다. 정해진 방법에 그리기, 추적 조사의 움직임 동영상은 복잡한 주파수 의존 점탄성 전단 계수, G * (ω)를보고하는 일반화 된 스톡스 아인슈타인 관계 (GSER)를 통해 변환됩니다. 이 방법은 이미지를 기반으로하므로, 기계적 특성도 동시에 3D 종양의 크기와 표현형의 질적 변화를보고 큰 투과광 공간 필드에 매핑됩니다. 현지화 침입에 의한 매트릭스 저하뿐만 아니라 시스템 교정과 관련된 하위 지역에 기계 응답을 대조 보여주는 대표적인 결과는 검증 데이터가 제공됩니다. 일반적인 실험 오류와 이러한 문제의 문제 해결에서 바람직하지 않은 결과도 제시된다. 이 프로토콜에서 구현 된 96 - 웰 배양 판 3D 포맷는 C치료 심사 분석 또는 기계적 미세 환경에 대한 치료 또는 생화학 적 자극의 영향에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 분자 이미징 microrheology은 측정의 상관 관계에 onducive.

서론

그것은 암 세포가 아닌 악성 포유류의 상피 세포에서와 같이, 주변의 세포 외 기질 (ECM) 및 기타 미세 환경의 구성 요소 ^1-9의 기계 및 생물 물리학 적 특성에 매우 민감하다는 문헌 기록의 성장 몸에서 분명하다. 우아한 기계론의 연구는 악성 성장의 행동과 형태 형성 ^2,3,10,11을 조절하는 복잡한 mechanosensitive 신호 파트너로 세포 강성의 역할에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 작품은 생물학적으로 관련 조직의 구조를 복원하고 조정할 수있는 기계와 발판 재료의 성장 및 광학 현미경 ^12-19으로 영상화 할 수있는 시험 관내 종양 모델에서 3D의 개발에 의해, 특히 촉진하고있다. 그러나, 종양 차례로 암 세포가 자신의 주변의 레올 수정 통해 미세 사이 mechanoregulatory이 대화의 다른 쪽은, 다소 남아공부하기가 더 어렵다. 예를 들어, 침략 과정에서, 종양의 주변에서 세포 차례의 mechanosensitive 성장의 행동에 영향을 미치는 ECM ^20-22의 지역이 저하 될 그 중간 엽 전이 (EMT)로 상피를 거쳐 매트릭스 메탈로 (MMPs의)의 발현을 증가시킬 수 있습니다 다른 근위부 종양 세포. 생화학 다양한 공정을 통해 암 세포는 지속적으....

프로토콜

1. 배양 종양 상체

1. 1 % 아가로 오스 용액을 얻었다 아가 로스 0.1 g과 함께 세포 배양 등급의 물 10 ㎖를 혼합한다.
2. 96 - 웰 플레이트에 잘으로 아가로 오스 솔루션의 40 μl를 분취하기 전에 70 ° C 이상 (표준 전자 레인지 나 가열 플레이트를 사용하여 약 14 초)에 열 아가로 오스 솔루션입니다.
3. 표준 기술을 사용하여 세포를 수확하는 동안 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
4. 세포 현탁액의 농도를 결정하기 위하여 hemacytometer를 사용한다.
5. 1,000 세포 / ml의 세포 현탁액을 희석하고 잘 경화 아가로 오스 침대를 포함하는이 희석 100 μl를 추가합니다.
6. 37 ° C와 5 % CO _2로 설정 배양기에서 하룻밤 진탕 샘플을 놓습니다.
7. 통에서 샘플을 제거하고 세포 배양 배지 100 μl를 추가합니다.
8. 원하는 직경에 도달 할 때까지 상체를 품어. 예를 들어, 후 구일, SPheroid는 직경이 약 450 μm의 수 있습니다. 이 시간 동안 신선한 성장 배지를 웰에 첨가 할 수 있지만, 이것은 구형 체의 제거를 초래할 것이기 때문에 흡인 피해야한다.

결과

G * 복잡한 모델 종양 미세 환경 내에서 지역화 된 위치에서 (ω) 측정의 유효성을 확인하기 위해 두 개의 초기 유효성 검증 실험을 실시 하였다. 첫째, 우리는 대량 진동 전단 레오 메타의 "황금 표준"에 대한 우리의 측정을 검증하기 위해 노력했다. 우리는 1.0 ㎎ / ㎖ 콜라겐의 농도 (전지 제외) 콜라겐 매트릭스의 동일한 샘플을 준비했습니다. 이러한 샘플은 ( "(이 프로토콜에 걸쳐 같은 매개 변수를 사용하여) 및 G의 결과 측정 '(ω)와 G 대량 레오 미터 (40mm 평행 판 구조를 사용하여 TA 인스트루먼트 AR-G2)으로하고 PTM으로 프로빙 된 ω ) (그림 2A)를 비교 하였다. 우수한 계약은 두 측정 사이에서 발견되었다. 둘째, 우리는 1.0 ㎎ / ㎖ 콜라겐 매트릭스 및 임베디드 추적 구슬을 준비 ECM의 레올 로지 포인트의 변화를 측정하는이 프로토콜의 기능을 설정합니다. 시료를 처리 하였다빠르게 콜라겐을 소화.......

토론

이 프로토콜에서 우리는 세로 방향으로 3D 종양 모델에서 ECM의 강성 로컬 변경 사항을 추적하기위한 강력하고 광범위하게 적용 전략을 소개합니다. 우리는이 방법은 종양의 성장과 침략 과정에서 매트릭스 리모델링에 연루 mechanosensitive 행동에 관심이 암 생물학 및 생물 물리학 자에 의해 채택 될 수 있다는 구상. 행렬 분해 반응 속도의 정확한 정량화 직접 매트릭스 리모델링에 연결되어 3D 종양 모델에서 매트릭스 메탈로, 리실 산화 효소 또는 다른 관련 생화학 종의 활동을 연구하는 사람들에게 특히 도움이 될 수 있습니다. 3D 종양 모델에 응용 프로그램이 여기에 설명을 넘어, 하나 더 시간이 지남에 따라 매트릭스의 레올 로지의 수정이 중요한 역할 ^{(46, 47)을} 담당하는 다른 질병 모델 시스템과 함께이 방법의 구현을 상상할 수 있었다. 이 방법의 유틸리티 소프트웨어 개선을 통해 향상 될을 지속적 더 자동과정을 전자 및 처리량을 증가시켜 연구를 허용한다. 이 다 잘 형식으로 사용하기 위해 동시에 많.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 유형 1 콜라겐	BD Biosciences, San Jose, CA	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	또는 기타 적절한 세포 유형
형광 마이크로 스피어	Life Technologies, Carlsbad, CA	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford, MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	또는 적절한 세포 배양 배지
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		고속 카메라가 포함되어 있습니다. 및 이미징 소프트웨어
MATLAB 소프트웨어	The Mathworks, Natick, MA

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