Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen
Summary
In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.
Abstract
Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.
Introduction
In dit protocol beschrijven we efficiënte methoden om genen in muizen macrofaag cellijnen met siRNA remmen en de effecten van de behandelingen die de aangeboren immuunrespons. Deze procedures worden uitgevoerd in 96-well formaat, waardoor RNAi schermen in middel- of high-throughput wijze.
In reactie op infectie, mens zet onmiddellijk aangeboren immuunrespons en een trager, maar specifieker adaptieve immuunrespons. Deze snelle aangeboren immuunrespons impliceert de werving en activering van fagocyterende aangeboren immuuncellen waaronder macrofagen 1. Klassiek geactiveerde macrofagen betrokken zijn bij acute ontstekingsreacties en produceren antimicrobiële eiwitten en verbindingen, cytokinen en chemokinen, en presenteren antigenen 2,3. Alternatief geactiveerde macrofagen een rol spelen bij het reguleren van de immuniteit, het handhaven tolerantie, weefselherstel en wondgenezing 4-8. Vanwege hun gemak functies, Macrofagen een rol in talrijke ziekten zoals atherosclerose, artritis, kanker en 9 spelen. Zo is de studie van macrofagen is een belangrijk onderzoeksgebied enige tijd in diverse ziektecategorieën.
Ondanks hun belang in de aangeboren immuunrespons, kan macrofagen uitdagend cellen om mee te werken. In het bijzonder is het moeilijk om doelmatige transfectie met lipide reagentia in macrofagen te verkrijgen zonder geassocieerde toxiciteit 10,11. Zelfs wanneer siRNA efficiënt afgeleverd macrofagen, de robuustheid van RNAi-geïnduceerde gen vaak knockdown kan tamelijk gematigd zijn en kunnen variëren van gen tot gen.
Om deze technische uitdagingen te overwinnen, hebben wij transfectie en knock-down technieken 12-16 geoptimaliseerd in twee muis macrofaag cellijnen, RAW264.7 17 en J774A.1 18. Deze aanpak maakt gebruik van de Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem voor transfectie; dit systeemeen combinatie van speciale reagentia en elektroporatie cellen in 96-well formaat 19 transfecteren. Na transfectie, beschrijven we methoden om cel herstel en de levensvatbaarheid te maximaliseren en de daaropvolgende siRNA-geïnduceerde gen knockdown maximaliseren. Ter illustratie van de bruikbaarheid van deze benadering beschrijven we een protocol voor siRNA levering aan deze macrofaag cellijnen, stimuleren deze cellen met lipopolysaccharide (LPS), en bewaken de aangeboren immuunrespons op het productieniveau van verscheidene pro-inflammatoire cytokines. Wij bieden sample data in welke doelgroep we de Toll-like receptor (TLR) familie, waarvan de leden voelen LPS en andere pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), om aangeboren immuniteit te regelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Talrijke studies gepubliceerd waarin individuele genen zijn het doelwit van siRNA in murine macrofagen. Terwijl lipide gemedieerde transfectie is gebruikt om siRNA leveren macrofaagcellijnen individueel, deze methoden lijden mogelijke effecten op de levensduur beperkt gen knockdown en variabiliteit van gen tot gen. Robuustere assays die kunnen worden gebruikt om genen in middel- of high-throughput fashion gericht ontwikkelen, optimaliseerden we technieken met de Amaxa Nucleofector 96 putjes pendelsysteem, die meer samen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.
Materials
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electrooration | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPM1-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96 well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96 well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFa Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT Bufer | Qiagen | 79216 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
- Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. . The innate immune response to infection. , (2004).
- Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
- Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
- Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
- Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
- Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
- Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
- Burke, B., Lewis, C. E. . The macrophage. , (2002).
- Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
- Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
- De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
- Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
- Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
- Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
- Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
- Fernandez-Botran, R., Větvička, V. . Methods in Cellular Immunology. 8, 8 (2001).
