광학적 바이오 센서 기술은 살아있는 세포에서 세포막 근처 질량의 변화를 감지 한 개별 세포와 세포 집단 모두에서 세포 반응을 수행 할 수있다. 이 프로토콜은 이러한 접근법을 사용하여 그대로 세포에서 G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조의 검출에 대해서 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
이온 채널을 선택적으로 이온이 플라즈마 막 (1)을 통해 흐르게함으로써 뉴런 및 다른 흥분성 세포 유형의 전기적 특성을 제어한다. 신경 세포의 흥분성을 조절하기 위해, 이온 채널의 생물 리 학적 특성은 종종 이종 체 채널 착물 2,3을 형성하는 채널 자체에 바인딩 신호 단백질 및 분자에 의해 수정된다. 살아있는 세포에서의 상호 작용의 시간 경과에 적은 정보를 제공하면서 채널 및 규정 단백질 사이의 상호 작용을 조사 전통적인 분석은 잠재적으로 단백질의 동작을 변경하고 대상의 생리 학적 관련성을 줄일 수 외인성 라벨을 필요로한다. 이러한 X-BODY 생명 과학 BIND 스캐너 시스템과 광 바이오 센서는, 공명의 변화를 감지하는, 새로운 라벨이없는 기술, 공진 파장 격자 (RWG) 광 바이오 센서를 사용하는 바이오 센서 주변의 빛을 반영합니다. 이 분석은 허용 상대 검출세포 접착의 리간드 유도 변화 확산 독성, 증식 및 세포막 근처 단백질 - 단백질 상호 작용의 변화로 인해 발생하는 바이오 센서의 표면에 부착 한 생세포의 바닥 부 내에 질량 변화. RWG 광 바이오 센서는 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에), 수용체 티로신 키나아제, 및 다른 세포 표면 수용체의 활성화 다음 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지하기 위해 사용되어왔다. 이온 채널 단백질 상호 작용의 리간드에 의한 변화는이 분석을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 이 논문에서, 우리는 한산한-B 나트륨 활성화 칼륨 GPCR에 의해 (K 나) 채널의 변조를 감지하는 데 사용되는 실험 절차를 설명합니다.
서론
생리 학적으로 중요한 상황에서 살아있는 세포를 검사하는 표적 세포의 생물학적 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 채널과 같은 coimmunoprecipitation 분석법 규제 세포질 단백질 사이의 상호 작용을 조사 분석법은 일반적으로 살아있는 세포의 상호 작용의 시간 경과에 약간의 정보를 제공한다. 현재 셀 기반 분석의 대부분은 그 찬란 태그 단백질의 전위와 같은 특정 세포 이벤트를 측정합니다. 이러한 분석은 잠재적으로 단백질의 동작을 변경하고 대상의 생리 학적 관련성을 줄일 수있다 또한 단백질의 변형을 요구한다. 시스템의 조작을 필요로 세포 활동의 연속 측정을 제공하고 그들의 가장 생리 학적으로 관련 국가 4 세포의 연구를 허용하지 않는 비 침습적 인 세포 기반 분석.
광 바이오 센서를 생산하도록 설계센서 표면에 결합되는 광의 특성에 측정 가능한 변화. 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 공진 파장 격자 (RWG) 기법을 포함 소멸 파를 이용하는 광 바이오 센서는, 주로, 센서 표면에 고정 생물학적 수용체에 결합하는 분자의 친화도 및 반응 속도를 검출하기 위해 사용되어왔다. 최근 시판 RWG 바이오 센서는 높은 공간 해상도 (최대 3.75 μM / 픽셀) 5에서 센서 표면에 부착 한 세포....
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프로토콜
1. 세포 배양 (플레밍과 Kaczmarek 18에서 적응)
- 2보다 큰 미만 10 구절이 분석에서 사용하기 전에 적절한 미디어 문화 세포. 안정적으로 쥐 한산한-B 단백질을 발현하는 형질 감염되지 않은 HEK-293 세포와 HEK-293 세포는 Leibovitz의 L-15 중간 10 %의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청과 항생제로 보충 절반 둘 베코의 수정 된 이글 매체와 반에서 재배된다. 500 ㎍ / ㎖의 네티 (G418)를 안정적으로 여유 채널의 발현을 선택 한산한-B를 표현하는 HEK-293 세포에 첨가된다. 0.25 % 트립신-EDTA 용액으로 요리에서 분리하여 70-90%의 합류 통로 세포.
2. 피브로넥틴 및 오발 부민과 티오 2 384도 광 바이오 센서 플레이트의 세포 외 기질 (ECM) 코팅
- 피브로넥틴 ECM 혼합물 및 알부민 블로킹 용액의 조제
- fibronect의 작업 솔루션을 준비합니다20.0 ㎖의 PBS에서 파이브로 넥틴의 5 μg / ML의 최종 농도와 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서. 1.0 ㎎ / ㎖의 주식 농도에서 200 배 희석 20.0 ㎖의 PBS 100 μl를 추가합니다. 피브로넥틴의 작업 솔루....
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결과
한산한-B 안정적 HEK-293 세포를 형질 전환 및 제어 형질 감염되지 않은 HEK-293 세포는 물론 384도, ECM 코팅 RWG 바이오 센서 접시에 1,000 세포 /에 씨앗을 품고 있었다. 바이오 센서의 중앙 1.5 mm 2의 이미지는 4,125 μm의 / 픽셀의 해상도 (그림 1)을 기록했다. 질량 밀도 구배지도는 사전 생성 및 BIND 스캔 소프트웨어와 함께 30 분 후 화합물 첨가 하였다. BIND보기 소프트웨어는베이스 라인 PWV에서 PWV 포스트 화합물의 추가 감산하여 GPCR 작용제 추가시 PWV의 변화를 결정하기 위해 이용되었다.
내인성 M1 무스 카린 수용체 작용제 carbamoylcholine 클로라이드 (카바 콜)가 19 안정적 HEK-293 세포는 PWV의 긍정적 증가 (도 2A)였다 발현 형질 감염되지 않은 제어 HEK-293 및 래트 슬랙-B 모.......
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토론
Z 프라임 (Z ') 요소는 높은 처리량 스크리닝 검사 (20)의 품질을 정량화하는 일반적인 통계 방법이며,이 분석에서 GPCR 작용제의 심사 SBS 호환 384 잘 분석에서 발생했기 때문에, 훌륭한을 제공합니다 이 분석 (21)의 안정성과 유효성의 측정. 1 애리조나 '값이 존재하지 않는 표준 편차와 데이터 포인트의 무한한 번호를 이론적으로 최적의 분석을 나타냅니다. 0.5 이하의 소폭 정보를 분석 간주과 0.5 사이의 알파벳 '값은 높은 처리량 검사 목적을위한 훌륭한 분석 간주됩니다. 이 데이터 집합에 대한 긍정적 인 컨트롤로 SFLLR carbachol을 활용하여 계산 Z '값이 분석은 높은 견고하고 얻어진 결과가 높은 중요 나타내는은 각각 0.79 0.81합니다.
384도 광 바이오 센서 플레이트, 세포 파종 및 화합물 첨가의 세포 외 기질 코팅이 실험에서 16 채널 Finnpipette (5-50 μ.......
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공개 사항
스티븐 M. Shamah는 X - BODY 생명 과학의 직원입니다.
감사의 글
저자는 안정적으로 쥐 한산한-B 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 관대 한 기부에 대한 예일 대학에서 박사 프레드 Sigworth의 실험실에서 박사 양양 얀에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한 저자는 비디오 소개에 표시 여유의 극저온 전자 현미경 상 동성 모델의 박사 Sigworth에게 감사의 말씀을 전합니다.이 연구는 LKK에 NIH 보조금 DH067517 및 NS073943에 의해 지원되었다
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical AB05057 | ||
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| 인간 혈장에서 추출한 피브로넥틴 | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| 닭 달걀 흰자위의 알부민 | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 트리플루오로아세테이트 염 | 시그마-알드리치 | S8701 | |
| 핀피펫(5-50 &마이크로; l) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND 스캐너 시스템 | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384웰 TiO2 코팅 플레이트 | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
참고문헌
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B.
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재인쇄 및 허가
