Un saggio di legame High Throughput MHC II per l'analisi quantitativa dei peptidi epitopi
Summary
Saggi biochimici con molecole ricombinanti umani MHC II grado di fornire rapide, approfondimenti quantitativi nella identificazione degli epitopi immunogenico, la cancellazione o il design. Qui, un saggio di legame peptide-MHC II scalata a 384 pozzetti è descritto. Questo formato conveniente, deve risultare utile nel campo della proteina deimmunization e progettazione di vaccini e sviluppo.
Abstract
Saggi biochimici con molecole ricombinanti umani MHC II grado di fornire rapide, approfondimenti quantitativi nella identificazione degli epitopi immunogenico, la cancellazione o il design 1,2. Qui, un saggio di legame peptide-MHC II viene scalata a 384 pozzetti. Il protocollo ridotta riduce i costi dei reagenti del 75% ed è più alta velocità di quanto precedentemente descritto protocolli da 96 pozzetti 1,3-5. In particolare, il disegno sperimentale permette l'analisi robusta e riproducibile fino a 15 peptidi contro un allele MHC II per 384 pozzetti ELISA. Utilizzando un'unica movimentazione robot liquido, questo metodo consente un ricercatore di analizzare circa novanta peptidi prova in triplice copia in un range di concentrazioni otto e quattro tipi di alleli MHC II in meno di 48 ore. Altri lavorano nei campi di proteine deimmunization o la progettazione di vaccini e sviluppo può trovare il protocollo per essere utile nel facilitare il proprio lavoro. In particolare, le istruzioni passo-passo e il formato visivodi Giove dovrebbe consentire ad altri utenti di stabilire rapidamente e facilmente questa metodologia nei propri laboratori.
Introduction
Le proteine sono la classe più rapida crescita di agenti terapeutici 6, e la rapida espansione delle condotte biotherapeutic ha focalizzato sempre più l'attenzione sulle sfide connesse con lo sviluppo e l'uso di farmaci proteici. Una considerazione unica deriva dal fatto che, in un sistema immunitario sano e funzionante, tutte le proteine extracellulari sono campionati dalle cellule presentanti l'antigene (APC). Una volta internalizzato da APC, una proteina viene scissa in piccoli frammenti peptidici, e segmenti immunogenici putativi sono caricati nella scanalatura di classe II principali proteine complessi di istocompatibilità (MHC II). I complessi peptide-MHC II vengono quindi visualizzati sulla superficie APC, e vere peptidi immunogeni, chiamati epitopi delle cellule T, forma ternaria complessi recettore delle cellule MHC II-peptide-T con recettori di superficie delle cellule T CD4 affini 7. Questo evento critico riconoscimento molecolare inizia una cascata di segnalazione complessa, che comporta l'attivazione delle cellule T, il rilascio di citochines, CD4 T cellulo-mediata B maturazione delle cellule, e, infine, la produzione di anticorpi IgG circolanti che si legano e azzera la proteina esogena incriminato. Così, proteine immunogeniche potrebbero essere deimmunized individuando costitutivi epitopi delle cellule T e mutando residui chiave responsabili MHC II formazione del complesso. È notato, comunque, che gli epitopi di cellule T possono essere numerosi e ampiamente distribuiti in tutta proteine immunogeniche, e la maggior parte delle mutazioni-epitopo eliminazione sono suscettibili di provocare una perdita involontaria di una funzione proteica o la stabilità. Pertanto, ingegneria deimmunized bioterapie può essere un obiettivo complesso e tecnicamente impegnativo, ma esistono diversi esempi di successo di T epitopi delle cellule progetti soppressione 3,5,8-12. Diversamente basato sovrainnesti "umanizzazione", che è in gran parte limitato a terapeutica dell'anticorpo, soppressione epitopo può essere applicato a qualsiasi sostanza bersaglio proteina indipendentemente sequenza, struttura, funzione, o la disponibilità di homologoci ponteggi umani. Il primo passo per l'attuazione di un tale approccio è l'identificazione di epitopi peptidici chiave incorporati all'interno della sequenza della proteina bersaglio.
Ad alto rendimento saggi biochimici utilizzando peptidi sintetici e di molecole ricombinanti umani MHC II grado di fornire rapide intuizioni preliminari nella identificazione degli epitopi e mitigazione 1,3-5. Questi saggi tipo ELISA può essere un potente complemento ad altri di progettazione e sviluppo di strumenti di proteine / vaccino. Per esempio, un approccio sperimentale consolidata di mappatura di epitopi si basa sul tempo, lavoro e notevoli risorse ex vivo saggi di proliferazione cellulare 15. In breve, la sequenza primaria di una proteina bersaglio viene prima divisa in un pannello di peptidi sovrapposti, spesso 15-meri con 12 residui sovrappongono tra peptidi adiacenti. Il pannello peptide è sintetizzato chimicamente e l'immunogenicità di ciascun peptide è testato in uno dei vari test immunologici diversi che impiegano Bloo perifericocellule d mononucleate (PBMC) isolate da donatori umani 13,14. Per garantire una maggiore fiducia nei risultati, i peptidi sono in genere testati in replicato con PBMC da 50 o più donatori diversi. Nei casi in cui deimmunization è l'obiettivo finale, il lavoro è aggravato ulteriormente la necessità di produrre pannelli supplementari di peptidi mutati e collaudare i nuovi pannelli peptidici in saggi PBMC prima di introdurre eventuali mutazioni deimmunizing nella proteina intera lunghezza per la successiva analisi funzionale 10. Mentre questi saggi cellulari rimangono il gold standard per valutare il potenziale immunogenico in pazienti umani, l'efficienza di un approccio esaustivo potrebbe essere migliorata prefiltraggio epitopi immunogeni putativi usando una rapida ed elevata produttività MHC II-peptide saggio di legame.
Analogamente, biochimici saggi di legame peptide-MHC II possono essere combinati con predittiva metodi in silico per accelerare radicalmente il processo di identificazione epitopo.Esistono una varietà di strumenti di calcolo per la previsione epitopo T cellulare; esempi includono ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, ARB 19, SMM-align 20, NetMHCIIpan 21, nonché strumenti proprietari come EpiMatrix di EpiVax 22. Allo stesso modo, i predittori epitopi sono stati recentemente associati ad altre bioinformatica e strumenti di modellazione molecolare per produrre proteine algoritmi deimmunization integrati, progettati per ridurre il rischio che le mutazioni deimmunizing potrebbero sconvolgere la struttura e la funzione delle proteine 23-26. Mentre diversi predittori epitopi hanno dimostrato di essere ragionevolmente accurata 27,28, risultati computazionali sempre richiedono validazione sperimentale. Rapid, ad alto rendimento, e convenienti metodi sperimentali sono più adatti come filtro preliminare in silico previsioni epitopi.
In modo simile, i predittori epitopi possono guidare la selezione antigene per vaccinolo retromarciaGY 29,30. Ad esempio, i progressi nella bioinformatica hanno dato intere schermate genoma che rapidamente identificare i candidati vaccini in forma di proteine intere o epitopi peptidici estratti da proteomi patogeni. Mentre questa tecnologia consente sta rimodellando scoperta e lo sviluppo di vaccini protettivi, introduce una nuova sfida sotto forma di intractably grandi liste di candidati vaccini immunogenico. Saggi di legame throughput elevato peptide-MHC II possono guidare la selezione degli epitopi quantificando peptide affinità di legame e la promiscuità vincolante tra più alleli MHC II. Come con proteine deimmunization, tali metodi sperimentali sono in ultima analisi necessarie per convalidare la previsione computazionale di porta promettente vaccino.
Qui, un saggio di legame peptide-MHC II scalata a 384 pozzetti è descritto. Il protocollo è altamente parallelo e riduce i costi dei reagenti del 75% rispetto al precedentemente descritto 96 pozzetti formati lastra 1,3-5. Utilizzando un unico liquidazioned robot manipolatore, questo metodo consente un ricercatore di analizzare facilmente circa novanta peptidi prova in triplice copia in un range di concentrazioni otto e quattro tipi di alleli MHC II in meno di 48 ore. Questo articolo descrive la configurazione di una piastra da 384 pozzetti ELISA per l'analisi di sette peptidi sperimentali contro un allele MHC II, ma calcolatrici foglio di calcolo sono forniti come materiale supplementare, in modo da scalare facilmente l'esperimento a qualsiasi numero di peptidi e / o MHC desiderati molecole II.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biotherapeutics si sono affermati come una pietra miliare della medicina moderna, che rappresentano quattro delle prime cinque farmaci più venduti nel 2012 32. Il settore biofarmaceutica ha mostrato una crescita sostenuta per diversi anni 6, e il continuo sviluppo di nuovi agenti, così come l'emergere dei biosimilari ha ampliato condotte biofarmaceutiche. Guardando al futuro, valutare e mitigare l'immunogenicità di terapie proteiche diventerà parte integrante dello sviluppo biotherapeut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R01-GM-098977 e R21-AI-098.122 per CBK e KEG. RSS è stato sostenuto in parte da una Luce Foundation Fellowship e in parte da una borsa di studio Thayer Innovation Program presso la Scuola di Ingegneria Thayer.
Materials
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Sigma | 221732 | |
| Citric Acid | Sigma | C1901 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma | S7907 | |
| Trizma HCl | OmniPur | 9310 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| 100% DMSO | Sigma | D8418 | |
| Octyl-β-D-Glucopyranaside | Fischer | 29836-26-8 | |
| Pefa Bloc SCF | Roche | 1158591600 | |
| Dulbecco’s 10X Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200-166 | |
| DELFIA Assay Buffer | Perkin Elmer | 4002-0010 | |
| DELFIA Enhancement Buffer | Perkin Elmer | 4001-0010 | |
| Europium Labelled Streptavidin | Perkin Elmer | 1244-360 | |
| L243 anti-HLA-DR antibody | Biolegend | 307602 | |
| Biotinylated tracer peptides | 21st Century Biochemicals | Custom Order | |
| Test peptides (1-4mg, 85% purity) | Genscript | Custom Order | |
| Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) | Benaroya Research Institute* | Custom Order | |
| 384-well white EIA/RIA plate | Thermo | 460372 | |
| Polypropylene 384-well plate | Costar | 3656 | |
| Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator | Axygen Asicentific | PCR-SP | |
| MilliQ Water | N/A | N/A | |
| Epimotion Liquid Handler (or similar) | Eppendorf | 5075 | |
| Select TS Plate Washer (or similar) | BioTek | 405 | |
| SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) | Molecular Devices | N/A | |
| *Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory | |||
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