Synapto核メッセンジャータンパク質の活性に依存する核内移行を研究するために海馬スライスからCA1原子力エンリッチ画分の単離
Summary
私たちは、海馬のCA1領域とスライスのtetanizedエリアからの核に富む画分のその後の単離における長期増強の誘導のための詳細なプロトコルを提供する。このアプローチは、学習および記憶の細胞モデルにおいて活性に依存する核タンパク質のインポートを決定するために用いることができる。
Abstract
勉強活動依存性タンパク質の発現、細胞内転座、またはリン酸化がシナプス可塑性の基礎となる細胞メカニズムを理解することが不可欠です。長期増強（LTP）および急性海馬スライスにおいて誘導される長期抑圧（LTD）が広く学習および記憶の細胞モデルとして受け入れられている。活動依存性タンパク質の動態を可視化するために、ライブセルイメージングまたは免疫組織化学の手法を使用する多くの研究があります。しかし、これらの方法は、単一ニューロンにおける蛍光タグ融合タンパク質の免疫細胞または過剰発現のための抗体の適合性に依存している。タンパク質のイムノは調査結果の独立した確認を提供する代替的な方法である。個別のtetanized海馬スライスからの細胞成分分画の製造における最初の制限要因は、材料の量が少ないです。第二に、処理手順は非常に重要ですlとさえ非常に短いとマイナーな操作のためスライスをivingすると、特定のシグナル伝達カスケードの活性化を誘導し得る。ここでは、ラット脳からの急性海馬スライスのCA1領域から十分な純度の核濃縮画分の十分な量を得るために最適化されたワークフローを説明する。代表的な例として、私たちはsynapto-核タンパク質のメッセンジャーのERK1 / 2リン酸化形態はヤコブが積極的にLTPの誘導時に核に移動し、CA1ニューロンの核濃縮画で検出できることを示している。
Introduction
シナプスN-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDARを）は、シナプスNMDARをの活性化に対し、シグナル伝達、シナプス可塑性および細胞の生存に重要な役割を果たす神経変性および細胞死を誘発することができる。これらの変更は、厳密に制御/調整された活動依存性遺伝子発現に依存し、このようにして活性化シナプスや樹状突起および核7との間に一定の通信を必要とする。 MAPは、ERK1 / 2シグナル伝達シナプスNMDARを下流のエフェクターであるとシナプス外NMDA受容体を介したシグナルがないか、またはERK1 / 2活性8,11に対する阻害効果を有するのに対し、NMDAR活性化によって誘導される遺伝子発現に関与していませんキナーゼ。
遠位樹状突起と核の間を往復することが示されているタンパク質の数があります。これらのタンパク質の多くは、核局在化シグナルを含有し、積極的に核6,9にダイニンとインポーチン依存的に微小管に沿って輸送される。 Interestinglyは、これらのメッセンジャーのいくつかの特定のシナプスの刺激に応答して、核への唯一のトランジット。例えば、サイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質2（CREB2）の逆行性輸送は、化学LTDなくLTP 12によって誘導される。ローカライズされたNMDAR依存シナプス刺激は、長期的な海馬可塑4に関与している転座法、核内にCREB調節される転写コアクチベーター（CRTC1）を駆動する。最近、蛋白質メッセンジャーヤコブは、シナプスとシナプス外NMDA受容体活性化の両方の後に核へ移行し、CREB依存性遺伝子の転写5を調節することが示された。信号のシナプスまたはシナプス外起源は、ヤコブの翻訳後修飾で符号化される。シナプス活性は、初代海馬培養物中の核へのその後の転座のための必要条件である180位（pJacobS 180）での重要なセリンでヤコブのERK1 / 2依存性リン酸化を誘導する。また、私nは急性海馬スライスのpJacobSのCA1ニューロンは180はシャファー側枝LTP後に核に移行したが1,10 LTDません。 pS180ヤコブは可塑性関連遺伝子の発現の増加につながり、この遺伝子の発現は、シナプス機能にフィードバックする。著しく対照的に、シナプス外NMDARを活性化がSer180でリン酸化されておらず、核内の異なるタンパク質複合体と関連する可能性があります後に核へ移行ヤコブは原因となる「CREBを遮断'とシナプスの接点10の後退。
synapto-核タンパク質のメッセンジャーの核内移行のほとんど発表された研究は、解離神経細胞初代培養で行われてきた。従って、そのような知見は、神経細胞の接続性と機能がはるかに優れた保存された海馬スライスを使用して、生理学的に関連性の高い状態で再現できるかどうかを確認するために興味深いものになるだろう。ここでは、LTPドを評価するための最適化されたプロトコルを提示イムノブロットによるタンパク質メッセンジャーの核移行をペンダント。この方法は、粗核画分中のタンパク質の活性依存性リン酸化を分析するのに適している。具体的には、現在のプロトコルは、急性CA1海馬スライス、誘導、およびLTPの記録の調製を含む。次に、CA1領域が微視的に刺激された領域を分離するために解剖される。私たちは、趙と同僚17で導入された変更でCellLytic核抽出キットにより提供される核を単離するためのプロトコルを組み合わせて変更しました。最適化された手順では、細胞膨張および核の放出を可能にする低張性緩衝液中で解剖し、CA1領域の溶解が含まれています。細胞溶解および核の形態は、顕微鏡検査により決定することができる。核濃縮は、短い遠心分離工程によって達成される。のNeuN及びNSE2、核または細胞質画分の特異的マーカーに対する抗体で免疫ブロットすると、このアプローチは速いとして使用できることを示しこれらの細胞成分分画を分離し、タンパク質リン酸化のような非常に不安定な翻訳後修飾を研究するために、再現性のプロトコル。さらに、この方法は、海馬スライスの解剖CA1領域に由来する小さな組織サンプルのために有利であり、海馬切片の免疫組織化学的に組み合わせて使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記のプロトコルに記載の手順は、どのように迅速にスライスの誘導エリアを分析し、活動依存性タンパク質のダイナミクスを研究するための核濃縮画分を準備し、LTPを、若年または成体ラットからスライス海馬急性の準備誘導し、記録するためのガイダンスを提供する。このアプローチは、互いに独立して使用されるいくつかの異なる方法の組み合わせに由来する。私たちは、ワークフロ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Materials
| Table 1. Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Axopatch 200B amplifier | Axon，USA | ||
| Axon Digidata acquisition system | Axon，USA | ||
| Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon，USA | ||
| Leica microscope | Leica TCS SP2，Germany | ||
| P-97 Standard microelectrode puller | Sutter，USA | ||
| Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
| SDS-PAGE system | BIORAD | ||
| Cooler | JULABO | ||
| Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
| Cooler | Julabo, F12 | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
| Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Table 2. Reagents | |||
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
| MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
| KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
| Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
| Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
| Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
| Phosphostop | ROCHE | ||
| Bicuculline | Tocris bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Table 4. Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
| beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Species | ||
| IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |
References
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