에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em> 체외</em> 혈관 신생 연구
Summary
관 형성 분석법은 시험관 내 혈관 신생을 측정하기위한 신속하고 정량적 방법이다. 내피 세포는 조절 된 미디어와 결합 기저막 추출물에 도금된다. 튜브 형성은 시간 이내에 발생하고 새로 형성된 세관은 쉽게 정량화.
Abstract
혈관 신생은 정상 조직의 발달과 상처 치료를위한 중요한 과정이지만 또한 병적 다양한 조건과 연관된다. 이 프로토콜을 이용하여, 혈관 신생은 신속하게 정량 시험 관내에서 측정 할 수있다. 차 또는 불멸화 된 내피 세포는 조절 된 매체와 혼합 기저막 매트릭스 상에 플레이 팅된다. 내피 세포는 조절 된 배지에서 발견 된 혈관 형성 신호에 반응하여 추천 모세관 구조를 형성한다. 관 형성은 혈관 내피 세포는 1 시간 및 루멘 함유 세관은 2 시간 내에 표시하기 시작하고 내 자신을 정렬하기 시작 신속하게 발생합니다. 튜브를 위상차 도립 현미경을 이용하여 가시화 될 수 있거나, 또는 세포를 형광 공 촛점 현미경 분석을 통해 시각화 및 튜브에 대한 종래의 칼 세인 AM으로 처리 될 수있다. 분기 사이트 / 노드의 수는 루프 / 메쉬, 또는 번호 또는 형성된 튜브의 길이를 쉽게 vitr에서의 측정 값으로서 정량화 될 수있다오 혈관 신생. 요약하면,이 분석은 유전자와, 빠른 재생 가능한 한 정량적 방식으로 추진 또는 혈관 신생의 억제에 관여하는 경로를 식별하기 위해 사용될 수있다.
Introduction
혈관 신생, 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 발달은 1-3 치유 장기의 성장, 배아 발생 및 상처 등의 다양한 공정에 매우 중요하다. 새로 조직으로 내피 세포, 공급 산소와 영양분 줄 지어 혈관을 개발, 조혈 세포에 의한 면역 감시를 촉진하고 노폐물 2,4를 제거합니다. 혈관 신생은 배아와 태아의 개발 과정에서 핵심 중요하다. 그러나,이 과정은 상처 치유, 골격 성장, 임신의 시간 동안을 제외하고 또는 월경주기 1 ~ 3시 성인 휴면 남아있다.
지난 20 년 동안, 혈관 신생을 조절하는 핵심 분자 메커니즘이 등장하기 시작했다. 혈관 신생은 인테그린, 케모카인, 앤지 오포 이에 틴, 산소 감지 에이전트, 접합부 분자와 내인성 억제제 (5)을 포함하여 프로와 항 혈관 신생 신호로 균형 엄격하게 규제 된 이벤트입니다. proang 번이러한 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 및 표피 성장 인자 (EGF)와 같은 iogenic 신호는 내피 세포가 혈관 내피 세포가 기저막을 분해하는 프로테아제를 방출 수용체 활성화. 내피 세포는 하루 당 6.7 밀리미터의 속도로 콩나물을 형성, 증식 및 이주.
혈관 신생은 암, 건선, 당뇨병 성 망막 병증, 관절염, 천식,자가 면역 질환, 감염성 질환, 및 죽상 동맥 경화증을 포함한 다양한 8-10 병적 상태와 관련된다. 인해 다양한 질병에서 혈관 신생의 중요성이 프로세스는 더 나은 치료제의 설계에 중요한 조절 유전자 및 경로를 이해한다.
관 형성 어 세이는 혈관 신생에 관여하는 유전자 또는 경로를 결정하기위한 신속하고 정량적 인 방법이다. 우선 1988에서 설명한이 분석의 기초 원리는 내피 세포가 혈관 신생 나누고 11-13 신호에 응답하여 급속하게 이주 할 수있는 능력을 유지하는 것이있다. 또한, 내피 세포는 분화 및 기저막 추출물 (BME)의 매트릭스에서 배양 관 형상 구조를 형성하도록 유도된다. 이 튜브는 접합부 단지를 통해 서로 연결 내피 세포에 둘러싸인 내강이 포함되어 있습니다. 관 형성은 대부분의 튜브 수량 및 혈관 신생 자극의 유형에 따라 2-6 시간 동안이 형성 분석에서 신속하게 발생한다.
내피 세포는 여러 종류의 일차 전지 및 불멸화 세포주 14,15 모두 포함이 분석을 위해 사용될 수있다. 본 문서에 사용되는 세포주는 마우스 3B-11 이었지만, 동일한 방법론은 이러한 HUVEC (인간)와 같은 세포 SVEC4-10 (마우스)와 같은 다른 내피 세포주 또는 일차 내피 세포에 적용 할 수있다. 에 따라 세포주가 사용된다 내피 CE 여부LLS가 변형 또는 비 변형되어, 최적화는 적절한 관 형성에 필요한 이상적인 시간을 식별하기 위해 수행 될 필요가있을 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
혈관 신생은 생리 학적 및 병리학 적 과정에 모두 참여하고있다. 혈관 신생에 관여하는 메커니즘을 공부하는 것은 혈관 신생의 주요 단계를 요점을 되풀이 분석의 사용이 필요합니다. 내피 세포의 관 형성 어 세이 다른 분석법에 비해 여러 장점을 제공한다. 그것은, 설치하기 쉽고 상대적으로 저렴하고, 시간 내에 세관을 생산하고 정량화 할 수있다. 또한, 24 또는 96 웰 플레이트에 완료 할 수있어,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 보건원의 국립 암 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원하고, NCI에 의해 UA5CA152907을 부여했다.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
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