מטריצה מקורית המופק פיברובלסטים רקמה מהונדסות היא כלי המתעוררים ליצירת מצע סטרומה אשר תומך בהתפשטות תאי אפיתל ובידול. הנה פרוטוקול יישום מתודולוגיה זו כדי להעריך את ההשפעה של סוגי תאים שונים של סטרומה בביולוגיה של תא הסרטני מוצג.
תרבויות organotypic 3D של תאי האפיתל במטריצה משובצת עם תאי mesenchymal נמצאות בשימוש נרחב ללמוד התמיינות תאי אפיתל ופלישה. סוג הזנב של עכברוש אני קולגן ו / או מטריצה שמקורם בתאי סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל כבר מועסק באופן מסורתי כמצעים למודל המיקרו מטריקס או סטרומה שלתוכו תאי mesenchymal (בדרך כלל fibroblasts) מאוכלסים. למרות שניסויים באמצעות מטריצות כאלה הם מאוד אינפורמטיבי, ניתן לטעון כי בשל נוכחות מכרעת של חלבון יחיד (כמו בסוג אני קולגן) או תכולה גבוהה של רכיבי קרום במרתף וגורמי גדילה (כמו במטריקס נובע מעכבר תאי סרקומה), מצעים האלה לא הטובים ביותר משקפים את תרומתו להרכב מטריצה שנעשתה על ידי תאי סטרומה בעצמם. ללמוד מטריצות ילידים המיוצרים על ידי fibroblasts עורי הראשוני בודד מחולים עם גידול הפרעת שלפוחיות גנטית (dystrophic נוטה, רצסיביולוזה epidermolysis), יש לנו להתאים פרוטוקול מטריצה מקורי קיים ללמוד פלישת תא גידול. Fibroblasts מושר לייצר מטריצה שלהם על פני תקופה ממושכת בתרבות. מטריצה מקורית זה היא אז מנותק ממנת התרבות ותאי אפיתל הם זורעים על זה לפני כל coculture מועלה לממשק אוויר הנוזלי. בידול ו / או פלישה נייד אז ניתן להעריך לאורך זמן. טכניקה זו מספקת את היכולת להעריך אינטראקציות תא אפיתל-mesenchymal בסביבת 3D ללא הצורך במטריצה סינתטית או זרה עם החסרון היחיד להיות תקופה הממושכת של זמן הנדרש כדי לייצר את המטריצה המקורית. כאן אנו מתארים את היישום של טכניקה זו על מנת להעריך את יכולתה של מולקולה בודדת לידי ביטוי על ידי fibroblasts, סוג VII קולגן, כדי לעכב את הפלישה של תאים סרטניים.
השימוש בחומר ביולוגי בתרבית רקמת 3D אפשר לחוקרים ללמוד על התנהגות תא במעבדה בתנאים פיסיולוגיים דומים יותר לסביבת in vivo מזה של אחד סכם עם הידבקות 2D ומצע פלסטיק. בפרט, צעדים גדולים קדימה נעשו בדוגמנות epithelia מרובדת עם האימוץ של שיטות תרבות 3D בממשק האוויר הנוזלי 1-4. טכניקות כגון נאמנות לחקות בידול keratinocyte ופלישת תאים סרטניים המאפשרת גמישות רבה יותר ונאמנות לחוקרים לומדים תהליכים אלה. הבחירה של מצע ביולוגי לחקות את סביבת סטרומה הייתה כרוכה בעיקר השימוש בסוג אני קולגן, מטריקס סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-הנחיל והדרמיס דה epidermized. לדוגמא, fibroblasts הסרטן קשור הוכחו לתרום לפלישת סרטן 5, ייזום, והתקדמות באמצעות אינטראקציות סטרומה אפיתל 6,7 when גדל במצעים כאלה.
תקן הזהב עבור מחקה את סביבת סטרומה בעור, האפיטל מרובדת הגדול ביותר והנחקר ביותר תוך שימוש בטכניקות כגון, נחשב להיות דה epidermized הדרמיס אנושי (DED). הכנת DED כוללת את ההסרה של האפידרמיס באמצעות trypsinization או התנערות פיזית מ3,4 עור גופת אדם. עם זאת, גישה לעור כזה יכול להיות קשה מאוד למעבדות אינן קשורות למוסדות קליניים, והדרמיס החולה הוא כמעט בלתי אפשרי להשגה. כחלופה, מעבדות לעתים קרובות להשתמש בשילוב של סוג אני קולגן (מבודד מזנבות עכברים) ו / או מטריצת סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל.
לאחר הגילוי, בשנת 1927 Nageotte 8 קולגן שיכול בקלות להיות מבודד באמצעות חומצה אצטית ומשקעי מלח, היישום שלה לתרבית רקמה היה חלוץ לאחר מכן על ידי Huzelלה ולעמיתי 9. ציפוי קולגן הוכיח שהוא עדיף על זכוכית לתרבית תאים של 29 זנים וexplants רקמות כנחקרו על ידי אהרמן ו -9 גיי. נכון לעכשיו, הסוג העיקרי של הקולגן המשמש בתרבית רקמה מבודד מגידי עכברוש זנב, והוא בדרך כלל קנה ממקורות מסחריים. עם זאת, החסרון לשחזור מצע נאמן הוא כי קולגן זנב החולדה אינו זהה לקולגן אנושי, או הדרמיס האנושי, שבו אני והסוג III collagens נמצאים כמרכיבים עיקריים, וקולגן זנב חולדה המבודד הוא תמיד מקוטע.
מטריקס סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל הוא תערובת חלבונים דביקה מופרש על ידי תאי סרקומה העכבר בתרבית Engelbreth-Holm-נחיל 10. המרכיבים העיקריים הם laminin, קולגן הסוג IV, proteoglycan סולפט הפרין, entactin וnidogen והיחסים של חלבונים אלה המדויקים ישתנו מיצוו כדי אצווה. מלבד פרו מבנייםteins, מטריצה זו מכילה גם רמות משמעותיות של גורמי גדילה כגון הפיכת β גורם גדילה, גורם גדילה באפידרמיס, גורם גדילה דמוי אינסולין 1, גורם גדילה פיברובלסטים שור, ונגזר גורם גדילה של טסיות דם אשר היה לשנות את התנהגות 11,12 סלולרית. והצביע לעבר המורכבות העצומה של מטריקס סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-הנחיל, סך של 1,851 חלבונים זוהו במחקר proteomic האחרון 13. לאור הטבע העשיר ומורכב של מטריצה זו, זהירות כבר יעצה כאשר לפרש ומשווה ניסויים שונים עם השימוש בו 11.
יש המעבדות שלנו עניין רב במחלות עור גנטיות, בעיקר אלו עם נטייה לפיתוח קרצינומה של תאים קשקשיים עורית (CSCC) 14. במקרה של ולוזה רצסיבי epidermolysis dystrophic (RDEB), מחלה שלפוחיות חמורה עם מוטציות בתאי מין בגן COL7A1 <sעד> 15-17, יש לנו קבענו כי microenvironment עורי בחולים אלו הוא גידול קידום 18. במהלך מחקר זה היינו להעריך את הגידול בקידום נכסים של fibroblasts עורי מוטבע בתוך מטריצת הקולגן סרקומה עכבר אני / Engelbreth-Holm-נחיל וחקר דרכים להערכת מטריקס הילידים, "התאים שלו. כדי להשיג זאת, אנו שונה בטכניקה קודמת מהמעבדה של לוסי ז'רמן עובד על עור אנושי ושווי 19,20. הטכניקה של ז'רמן הצליחה לשחזר עור אנושי עם קרום במרתף מאורגן היטב באמצעות תרביות keratinocyte ופיברובלסטים האנושיים ראשוניות בהעדר פיגום סינטטי או מת.
עמ 'במאמר זה את הצעדים המשמשים לשחזר microenvironment עורית סטרומה גידול (מטריצה מקורית) נגזרים באופן ישיר מfibroblasts סטרומה העיקרי במבחנה מתוארות 18. מטריצות שפת אםroduced ידי תרבות לטווח הארוך של fibroblasts שמשו עורי שווה ערך לassay לפלישת תא CSCC. אנו מציגים נתונים באמצעות מטריצה מקורית נגזרה משתי המטריצה תאית מופרש על ידי fibroblasts RDEB (חסר בסוג VII קולגן (C7)) או מfibroblasts RDEB retrovirally transduced עם קולגן סוג VII להביע לבנות ולהדגים את ההשפעה העמוקה של קולגן יחיד על גידול תא פלישה.
בשל אופייה של ניסוי זה, את הסך כל הזמן הנדרש להשלמה יכול להיות עד חודשים. במשך כל הזמן הזה, שיטות טיפול ותרבות רקמת סטרילית עליונה חייבים להיות מועסקות על מנת למנוע זיהום חיידקים.
מלבד תפקידה כc…
The authors have nothing to disclose.
APS נתמך על ידי דברה הבינלאומית וקרן העור הבריטית. YZN נתמך על ידי A * STAR – אוניברסיטת דנדי שותפות PhD התכנית.
L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
DMEM with l-glutamine, | Life Technologies | 11995-073 | |
4,500 mg/L d-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | |||
100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100um 25um diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |