組織操作された線維芽細胞由来の天然のマトリックスは、上皮細胞の増殖および分化を支持する間質基質を生成するための新興のツールである。ここでは、腫瘍細胞の生物学上の異なる間質細胞タイプの影響を評価するためにこの方法を適用するプロトコルが提示される。
間葉系細胞が埋め込まれたマトリクス上の上皮細胞の3次元器官型培養物は、広く上皮細胞分化および浸潤を研究するために使用される。 Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞由来のラット尾I型コラーゲンおよび/またはマトリックスは、伝統的に、間葉細胞(通常、線維芽細胞)が移入されその中にマトリックスまたは間質微小環境をモデル化するために基板として用いられてきた。このようなマトリックスを用いた実験は非常に有益ですが、それはその原因なマウス由来の行列のように、単一のタンパク質(たとえば、I型コラーゲンのように)か、基底膜成分と成長因子の含有量が高い(最優先の存在に主張することができます肉腫細胞)、これらの基板は、最高の間質細胞自身によって行われたマトリックス組成への貢献度を反映していない。腫瘍を起こしやすい、遺伝水疱性障害(劣性ジストロフィーの患者から単離された初代皮膚線維芽細胞によって産生さネイティブ行列を研究するために、表皮水疱症)、我々は、腫瘍細胞の浸潤を研究するために、既存のネイティブ行列プロトコルを適応している。線維芽細胞は、培養中の長期間独自のマトリックスを産生するように誘導される。この天然のマトリックスは次いで、培養皿から剥離され、全体の共培養は、空気 – 液体界面まで上昇させる前に、上皮細胞はその上に播種する。細胞分化および/または浸潤、次いで経時的に評価することができる。この技術は、唯一の欠点は、天然のマトリックスを生成するために必要な長期間である、合成または外来マトリックスを必要とせずに、3次元設定における上皮 – 間葉細胞の相互作用を評価する能力を提供する。ここでは、腫瘍細胞浸潤を阻害するために、VII型コラーゲン、線維芽細胞によって発現される単一分子の能力を評価するためにこの技術の適用を記載している。
三次元組織培養における生体材料の使用は、2D接着性プラスチック基板とで要約のものよりインビボ環境により類似の生理学的条件下で、実験室における細胞の挙動を研究する研究者を有効にしている。特に、長足の進歩が前方気液界面1-4における3次元培養法を採用することで重層上皮のモデル化がなされている。このような技術は忠実にケラチノサイトの分化およびこれらのプロセスを研究する研究者のための柔軟性と忠実度を可能にする腫瘍細胞の浸潤を模倣する。間質環境を模倣する生体材料の基板の選択は、主にI型コラーゲン、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫行列およびデepidermized真皮の使用を伴っています。例えば、癌関連線維芽細胞が癌の浸潤5に寄与することが示されている、開始、および進行間質上皮相互作用を介して、6,7 WHENこのような基板で栽培。
皮膚内の間質環境を模倣するためのゴールドスタンダードは、このような技術を用いて、最大かつ最も広く研究されている重層上皮は、人間の真皮(DED)を解除epidermizedされるように考えられている。 DEDの調製は、人間の死体皮膚3,4からトリプシン処理または物理的解離を介した表皮の除去を含む。しかしながら、このような皮膚へのアクセスは、医療機関に関連付けられていない研究室のために非常に困難であることができ、病気の真皮を得ることが近くに不可能である。別の方法として、研究室は頻繁にI型コラーゲン(ラット尾から分離)および/またはEngelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫マトリックスタイプを組み合わせて使用します。
コラーゲンは容易酢酸および塩沈殿を用いて単離することができることNageotte 8 1927年の発見後、組織培養への適用は、その後Huzelによって開拓されたLAや同僚9。コラーゲンコーティングはアマンとをゲイ9によって問い合わせなど29株および組織外植片の細胞培養用のガラスよりも優れていることが判明した。現在、組織培養に用いられるコラーゲンの主要なタイプは、ラット尾の腱から単離され、通常の商業的供給源から購入される。しかし、忠実な基板要約のための欠点は、ラット尾部コラーゲンI型およびIII型コラーゲンは、主要な成分として存在し、単離されたラット尾部コラーゲンは、常に断片化されたヒトコラーゲン、またはヒト真皮、同一ではないということである。
エンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫マトリックスは、培養されたエンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫細胞から分泌される10ゼラチン状のタンパク質混合物である。主要成分は、ラミニン、IV型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンおよびニドゲンであり、これらのタンパク質の正確な比率は、バッチからバッチに変化します。さておき、構造プロからteins、このマトリックスはまた、増殖因子β、上皮成長因子、インスリン様成長因子1、ウシ線維芽細胞成長因子、および細胞挙動11,12を変化させるであろう血小板由来成長因子の形質転換のような成長因子の有意なレベルを含有する。エンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫行列の複雑性の方を向いて、1851のタンパク質の総量は、最近のプロテオミクス研究13で同定された。解釈し、その11を利用して様々な実験を比較するとき、この行列の豊かで複雑 な性質に照らして、十分に注意が知らされていた。
私たちの研究室では、遺伝性皮膚疾患、皮膚扁平上皮癌(CSCC)14を発症する素因を持つ特に強い関心を持っている。 COL7A1遺伝子に劣性栄養障害性表皮水疱症(RDEB)、生殖細胞変異を伴う重度の水疱性疾患の場合<s> 15〜17まで、我々は、これらの患者における皮膚微小環境18を促進する腫瘍であることを決定した。この研究の過程で、我々は、コラーゲン内のI / Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫行列を組み込み、細胞自身の、ネイティブの行列を評価する方法を検討した皮膚線維芽細胞の性質を促進する腫瘍を評価することができませんでした。これを達成するために、我々はヒト皮膚同等物19,20に取り組んでルーシー·ジェルマンの研究室から以前の手法を変更しました。サンジェルマンの技術は、合成または死体足場がない状態で初代ヒトケラチノサイトおよび線維芽細胞培養を用いてよく組織基底膜をヒトの皮膚を再構築することができました。
本研究では、皮膚の腫瘍間質微小環境(ネイティブ行列)反復するために使用する手順は、in vitroでの一次間質性線維芽細胞に直接由来は18に記載されている。ネイティブの行列をP線維芽細胞の長期培養によりroducedはCSCC細胞浸潤についてアッセイするために真皮同等物として使用した。私たちは、RDEB線維芽細胞(VII型コラーゲン(C7)が欠損した)が分泌する細胞外マトリックスのいずれかから、またはレトロウイルス腫瘍上の単一のコラーゲンの絶大な効果を構築し、実証する表現VII型コラーゲンを用いて形質導入RDEB線維芽細胞から誘導されたネイティブの行列を使用してデータを提示細胞浸潤。
これにより、実験の性質のために、完了のために必要な総時間は2ヶ月までとすることができる。この時間を通して、細心の注意と、無菌組織培養の実践は、微生物汚染を防止するために使用しなければならない。
脇コラーゲンのヒドロキシプロリンとヒドロキシリシンの合成における補因子としての役割から、アスコルビン酸は、線維芽細胞22</…
The authors have nothing to disclose.
APSは、デブラ·インターナショナルと英国のスキン財団によってサポートされています。ダンディーパートナーシップ博士号プログラムの大学 – YZNはA * STARはサポートされています。
L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
DMEM with l-glutamine, | Life Technologies | 11995-073 | |
4,500 mg/L d-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | |||
100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100um 25um diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |