Tissue Engineering av tumör Stromal mikromiljö med Ansökan till Cancer Cell Invasion

Summary

Vävnadsteknisk fibroblast-härledd infödda matris är ett framväxande verktyg för att generera en stromal substrat som stöder epitelcellsproliferation och differentiering. Här ett protokoll tillämpa denna metod för att bedöma effekterna av olika stromaceller celltyper på tumörcellbiologin presenteras.

Abstract

3D organotypiska kulturer av epitelceller på en matris inbäddat med mesenchymala celler används i stor utsträckning för att studera epitelial celldifferentiering och invasion. Rat svans typ I-kollagen och / eller matris kommer från Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkomceller har traditionellt används som substrat för att modellera matrisen eller stromal mikromiljö i vilken mesenkymala celler (vanligen fibroblaster) är befolkade. Även om experiment med användning av sådana matriser är mycket informativt, kan det hävdas att på grund av ett tvingande närvaron av ett enda protein (t ex i typ I-kollagen) eller en hög halt av basalmembrankomponenter och tillväxtfaktorer (såsom i matrisen härrörande från mus sarkomceller), dessa substrat inte bäst speglar bidraget till matrissammansättning gjorts av stromaceller själva. Att studera infödda matriser som produceras av primära dermala fibroblaster isolerade från patienter med en tumör benägen, genetisk blåsor disorder (recessiv dystrofiskepidermolysis bullosa), har vi anpassat en befintlig infödda matris protokoll för att studera tumörcellsinvasion. Fibroblaster induceras att producera sin egen matris under en längre tid i odling. Denna nativa matris därefter lösgöras från odlingsskålen och epitelceller sås på det innan hela samodling höjes till luft-vätskegränsytan. Celldifferentiering och / eller invasion kan sedan utvärderas med tiden. Denna teknik ger möjlighet att bedöma epithelial-mesenchymal cell-interaktioner i ett 3D-inställning utan behov av en syntetisk eller främmande matris med den enda nackdelen är den långa tidsperiod som krävs för att producera den nativa matrix. Här beskriver vi tillämpningen av denna teknik för att bedöma förmågan hos en enda molekyl uttryckt av fibroblaster, typ VII kollagen, för att hämma tumörcellinvasion.

Introduction

Användningen av biomaterial i 3D vävnadskultur har gjort det möjligt för forskare att studera cellens beteende i laboratoriet under fysiologiska förhållanden som mer liknar en in vivo-miljö än i en rekapituleras med 2D vidhäftning och ett plastsubstrat. Speciellt framåt stora framsteg har gjorts i modellering stratifierat epitel med antagandet av 3D odlingsmetoder vid luft-vätske-gränssnittet ^1-4. Sådana tekniker härma troget keratinocytdifferentieringen och tumörcellsinvasion som möjliggör större flexibilitet och trohet för forskare som studerar dessa processer. Valet av biomaterial substrat för att efterlikna den stromal miljön har i första hand inneburit att användningen av typ I-kollagen, Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matris och de-epidermized dermis. Exempelvis har cancerassocierade fibroblaster visat sig bidra mot cancer invasion ^5, initiering och progression via stromal-epithelial interaktioner ^6,7 when odlas i sådana substrat.

Guldmyntfoten för att imitera stromal miljön i huden, den största och mest studerade stratifierat epitel som använder sådan teknik, anses vara de-epidermized mänskliga dermis (DED). Framställning av DED innebär avlägsnande av epidermis via trypsinering eller fysisk tagande från humant kadaver ^3,4. Dock kan tillgång till en sådan hud vara mycket svårt för laboratorierna inte förknippas med kliniska institutioner, och sjuka dermis är nära omöjligt att få. Som ett alternativ, laboratorierna använder ofta en kombination av typ I-kollagen (isolerad från skolästfiskar) och / eller Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matris.

Efter upptäckten 1927 av Nageotte ⁸ att kollagen kan lätt isoleras med användning av ättiksyra och saltutfällning, dess tillämpning på vävnadskultur därefter uppfunnen av Huzella och kollegor ^9. Kollagen beläggning visade sig vara överlägsen till glas för cellodling av 29 stammar och vävnadsexplantat som förhörs av Ehrmann och Gey ^9. För närvarande är den viktigaste typen av kollagen som används i vävnadsodling isoleras från råttsvanssenor, och är oftast köpas från kommersiella källor. Emellertid är nackdelen för trogen substrat rekapitulation att råttsvanskollagen är inte identisk med humant kollagen, eller de humana dermis, där typ I-och III-kollagener är närvarande som huvudbeståndsdelar, och isolerade råttsvanskollagen är invariably fragmenterad.

Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matris är en geléproteinblandning som utsöndras av odlade Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkomceller ^10. De viktigaste beståndsdelarna är laminin, typ IV kollagen, heparinsulfat proteoglycan, entaktin och nidogen och de exakta proportionerna av dessa proteiner kommer att variera från parti till parti. Förutom strukturella proproteiner, har denna matris också signifikanta nivåer av tillväxtfaktorer, såsom transformerande tillväxtfaktor β, epidermal tillväxtfaktor, insulinliknande tillväxtfaktor 1, bovint fibroblasttillväxtfaktor och blodplättshärledd tillväxtfaktor som skulle kunna ändra cellbeteende ^11,12. Pekar mot komplexiteten i Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matris, har totalt 1,851 proteiner identifieras i en nyligen proteomic studie ^13. Mot bakgrund av den rika och komplexa karaktär denna matris har försiktighet fått rådet vid tolkningen och jämföra olika experiment med hjälp av det ^11.

Våra laboratorier har ett stort intresse för genetiska hudsjukdomar, särskilt de med en benägenhet att utveckla kutan skivepitelcancer (CSCC) ^14. I fallet med recessiv dystrofisk epidermolysis bullosa (RDEB), en allvarlig blåsbildning sjukdom med nedärvda mutationer i COL7A1-genen <supp> 15-17, har vi bestämt att huden mikromiljö hos dessa patienter är tumör främja ^18. Under loppet av denna undersökning kunde vi inte bedöma tumören främja egenskaper dermala fibroblaster inbäddade i kollagen I / Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matris och undersökt metoder för att bedöma cellernas egna, infödd matris. För att uppnå detta, ändrade vi en tidigare teknik från laboratoriet av Lucie Germain arbetar på mänsklig hud ekvivalenter ^19,20. Germain teknik var kunna återskapa mänsklig hud med välorganiserad basalmembran med användning av primära humana keratinocyter och fibroblast-kulturer i frånvaro av en syntetisk eller avliden scaffold.

I denna uppsats de steg som används för att sammanfatta den kutana tumörer stromal mikromiljö (native matris) härstammar direkt från primära stromala fibroblaster in vitro beskrivs ^18. Native matriser producerad genom långtidsodling av fibroblaster användes som en dermal ekvivalent med analys för CSCC cellinvasion. Vi presenterar data med hjälp av infödda matris kommer från antingen den extracellulära matrisen utsöndras av RDEB fibroblaster (med brist på typ VII kollagen (C7)) eller från RDEB fibroblaster retroviralt omvandlade med en typ VII kollagen uttrycker konstruera och demonstrera djupgående effekt på en enda kollagen på tumör cellinvasion.

Protocol

Denna studie genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen Principer och godkändes av lämpliga etiska kommittéer. 1. Beredning av media och reagens Framställning av 200x av L-askorbinsyra 2-fosfat lager Lös upp 29 mg L-askorbinsyra 2-fosfat per 5 ml av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM)-lösning och filtreras genom 0,22 | im membranfilter. Affär som 0,25 ml sterila alikvoter i -20 ° C. Lägg till 0,25 ml alikvot av 200x L-askorbinsyra 2-fos…

Representative Results

Denna teknik öppnar upp möjligheten att undersöka och jämföra den invasiva beteende av tumörceller (i detta fall CSCC) under olika 3D-stromal miljöer. Med denna teknik kan inte bara C7-brist infödda matriser som intagits RDEB huden miljö skapas, utan också ytterligare matriser som är genetiskt manipulerade till över-express C7 18. Såsom framgår av fig. 2, invasion av RDEB CSCC keratinocyter var signifikant retarderad i C7-uttrycker nativa matriser i jämförelse med C7-bri…

Discussion

På grund av karaktären av detta experiment kan den totala tid som krävs för slutförande vara upp till två månader. Under hela denna tid, måste största försiktighet och steril vävnadsodlingsmetoder användas för att förhindra mikrobiell förorening.

Bortsett från dess roll som en kofaktor i syntesen av hydroxiprolin och hydroxilysin av kollagener, stimulerar askorbinsyra kollagen specifik mRNA-expression i fibroblaster ^22. Askorbinsyran val…

Materials

L-Ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960
DMEM with l-glutamine,	Life Technologies	11995-073
4,500 mg/L d-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate
100x Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070
Vaseline	VWR	PROL28908.290
Clonal cylinders	Sigma	Z370789
Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100um 25um diameter 100/pk	Millipore	NY1H02500
Bent stainless steel wire mesh support	Made in house		Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates