담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

요약

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

초록

많은 단백질은 다른 단백질과 상호 작용을 일시적으로 또는 생물학적 기능을 수행하기 위해 다중 단백질 복합체에 통합되어 있습니다. 이분자 형광 보완 (BiFC)는 식물 세포에서 이러한 상호 작용을 모니터링 할 수있는 생체 내 방법입니다. 제시된 프로토콜 추궁 후보 단백질이 형광 단백질의 상보 반쪽에 융합되고, 각 구조물은 아그로 박테 리움 - 매개 형질 전환을 통해 식물 세포 내로 도입된다. 이어서, 단백질은 일시적으로 담배 잎에서 발현되고 복원 된 형광 신호는 그대로 셀의 공 초점 레이저 주사 현미경으로 검출 할 수있다. 이것은 상호 작용 자체뿐만 아니라 시각화를 허용하지만, 또한 단백질 복합체의 세포 내 지역화는 결정될 수있다. 이를 위해, 형광 태그를 함유하는 표지 유전자는 이와 같은 t 셀룰러 구조를 시각화 BiFC 구조와 함께 공 발현 될 수있다그는 세망, 미토콘드리아, 골지체 또는 원형질막을 세포질. 형광 신호를 직접 표피 잎 세포 또는 쉽게 변형 담배 잎으로부터 단리 할 수​​있다 단일 원형질체에서 모니터링 할 수있다. BiFC 이상적으로 살아있는 세포 내에서 자연 환경에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하기에 적합합니다. 그러나, 식 강한 프로모터에 의해 구동되어야하고 상호 작용 파트너 인해 상호 작용 메카니즘을 방해 할 수있는 비교적 큰 형광 태그의 융합으로 변성되어 있음을 고려하여야한다. 그럼에도 불구하고, BiFC는 coimmunoprecipitation 같은 단백질 - 단백질 상호 작용, 생체 풀다운 분석 또는 효모 두 하이브리드 실험을 조사하고 다른 일반적으로 적용되는 방법에 대한 훌륭한 보완적인 접근 방식입니다.

서론

단백질 복합체의 형성을 공부하고 생체 내에서 식물 세포에서의 현지화는 셀룰러 네트워크를 조사하는 것이 필수적입니다, 신호 및 신진 대사 과정. BiFC 직접 살아있는 식물 세포 ^1-5 내에서의 자연 환경에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화 할 수 ^{있습니다.}

BiFC에서 재구성 형광 단백질에 형광 단백질 리드의 두 비 형광 N-및 C-말단 조각의 보완에 접근. 많은 다른 형광 단백질의 단편은 녹색 형광 단백질 (GFP) 화학적 세 가지 잔기 ^(6)에 의해 형성되어있는 발색단 예 : 단백질 상호 작용을 검출하기 위해 사용되어왔다. 형광 단백질은 관심의 두 단백질에 융합 될 수있는 두 개의 비 형광 조각 될 수있는 루프 또는 ß-가닥 내 반감 될 수있다. 분석은 어떤 세포 내 compartme에 상호 작용을 검출하는데 사용될 수있다유전자 융합 단백질을 표현하기 위해 수정 될 수있는 기적으로 성장하는 유기체 또는 세포 NT. 이 단백질은 세포 내에서 근접에 오면, 형광 재구성되고 외인성 또는 형광 염료 ^(3)의 추가없이 현미경에 의해 모니터링 될 수있다.

단백질은 쉽게 담배 생성 ....

프로토콜

1. BiFC의 변환은 아그로 박테리아에 구축

1. BiFC 구조의 클로닝
   1. 측면에서는 attB - 사이트를 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 적절한 템플릿에서 관심의 유전자를 증폭. 교정 중합 효소를 사용하여 PCR을 수행합니다. 설계된 프라이머 조합 어닐링 단계의 길이와 단편 크기에 따른 연신 공정의 길이를 적응시킨다. 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 확인 PCR 클린 - 업 키트를 사용하여 정제.
   2. 얻어진 단편 BP 반응과 BP의 재조합 효소를 사용하여 입력 벡터를 수행합니다. 항목 벡터의 150 NG와 attB-PCR 제품의 15-150 NG를 혼합, BP의 재조합 효소의 2 μl를 추가하고 8 μL의 총 부피에 TE 버퍼와 입력합니다. 실온에서 1 시간 동안 반응을 품어 37 ℃에서 10 분 동안 2 μL 테 K를 추가하여 반응을 중지
   3. 관할 E.으로 전체 반응을 변환 대장균 DH5α, 세포와 벡터에 DNA 단편의 해당 위치에 식민지 PCR에 의해 얻어진 식민지 화면. 양의 플라스미드 DNA 서열은 돌연변이의 부재를 확인하기 위해 수행된다.
   4. LR의 재조합 효소를 사용하여 해당 대상 벡터와 LR 재결합을 위해 얻어진 항목 복제를 사용합니다. 대상 벡터....

결과

이 예에서는 막 도킹 단백질 AtTPR7 및 Toc64와 세포질 분자 샤페론 HSP90의 상호 작용을 모니터링하는 BiFC 방법을 사용했다. AtTPR7는 초 translocon의 일부이며 아마도 ER 막에 번역 후 전위에 대한 분비 preproteins을 제공 세포질 보호자와 상호 작용합니다. 마찬가지로, 엽록체 외부 봉투에 Toc64는 HSP90 관련 엽록체 preproteins를 수신하여 번역 후 수입의 역할을합니다. 두 단백질 HSP90의 C-말단 MEEVD 모티브와의 상호 작용을 매개 세포질 노출 TPR 도메인을 포함한다.

단백질은 형광 태그가 세포질 도메인에 연결되어 있으며, 따라서 단백질의 타겟팅 및 막 삽입을 방해하지 않는 것을 보장 금성 ^N에 도킹 단백질을 함유 TPR 도메인 융합 적합한 대상 벡터로 특정 콤비 네이즈에 의해 클로닝 하였다. HSP90, SCFP ^C의 경우

토론

BiFC 실험 계획에 여러 지점이 고려되어야한다. 관심의 단백질에 대한 구조적 정보가 필요하지 않지만, 토폴로지는 막 단백질에 걸친 작업을 할 때 알고 있어야합니다. 형광 단백질은 동일한 세포 내 구획에서 상주하거나 상호 작용을 허용하는 멤브레인의 동일 측면에 직면한다. N-말단 서열을 타겟팅 필요 단백질을 분석 할 때 당연히, 단지 C-말단 태그가 고려 될 수있다. 그 태그는 GFP-태그 된 단백질을 발현함으로써, 예를 들면, 미리 세포 내 현지화를 테스트하는 것이 바람직하다 또한 단백질의 적절한 표적 또는 막 삽입을 방해하는 것이 가능하기 때문이다. 또한, 음성 대조군은 항상 포함되어야한다. 이 예에서 우리는 세포질에 SCFP ^C를 표현하는 구조를 생성합니다. 그러나, 상호 작용하는 것으로 예상되지 않은 단백질은 음성 대조군으로 사용할 수있다. 적절한 표현 (을)를 확인하려면F 형광가 보이지 특히, 침투 나뭇잎이나 원형질체의 단백질 추출물을 SDS-PAGE 및 단백질 발현을 실시 할 수있는 구조는, 각각.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
의 Serva 28302pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning