जिगर के श्वेतकोशिका भर्ती अनूठा यकृत sinusoidal endothelial कोशिकाओं से तैयार कर रहे हैं जो यकृत sinusoids की विशेष चैनलों के भीतर होता है. शारीरिक कतरनी तनाव की शर्तों के तहत मानव यकृत sinusoidal अन्तःचूचुक भर श्वेतकोशिका भर्ती के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी इस प्रक्रिया कायम करना जो आणविक तंत्र की व्याख्या कर सकते हैं सुविधा.
मानव यकृत के ऊतकों में श्वेतकोशिका घुसपैठ सभी वयस्क भड़काऊ यकृत रोगों में एक सामान्य प्रक्रिया है. क्रोनिक घुसपैठ सिरोसिस को फाइब्रोसिस और प्रगति के विकास ड्राइव कर सकते हैं. जिगर के श्वेतकोशिका भर्ती मध्यस्थता कि आणविक तंत्र को समझना जिगर की बीमारी के लिए महत्वपूर्ण चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान कर सकता है. श्वेतकोशिका भर्ती के दौरान कुंजी बातचीत कतरनी तनाव की शर्तों के तहत अन्तःचूचुक साथ भड़काऊ कोशिकाओं की है. जिगर में भर्ती यकृत sinusoidal endothelial कोशिकाओं (HSEC) द्वारा तैयार कर रहे हैं जो यकृत sinusoids की कम कतरनी चैनलों के भीतर होता है. यकृत sinusoids भीतर स्थितियां विशिष्ट प्रवाह दरों पर मानव HSEC monolayers से अटे चैनलों के माध्यम से ल्यूकोसाइट perfusing द्वारा recapitulated किया जा सकता है. इन परिस्थितियों में ल्यूकोसाइट endothelial भर में एक रेंगने कदम और बाद स्थानांतरगमन द्वारा पीछा सक्रियण और फर्म आसंजन के बाद एक संक्षिप्त tethering कदम से गुजरनापरत. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, इस 'आसंजन झरना' के हर कदम कल्पना और ऑफ़लाइन विश्लेषण के बाद दर्ज किया जा सकता है. Endothelial कोशिकाओं या ल्यूकोसाइट इस प्रक्रिया के दौरान विशिष्ट अणुओं की भूमिका निर्धारित करने के लिए inhibitors के साथ pretreated किया जा सकता है.
अब यह अच्छी तरह से सामान्य रूप में श्वेतकोशिका भर्ती multistep आसंजन झरना 1 का प्रतिमान है कि इस प्रकार की स्थापना की है. इस पोत दीवार अस्तर endothelial कोशिकाओं द्वारा रक्त बहने से ल्यूकोसाइट का कब्जा शामिल है. प्रारंभ में, ल्यूकोसाइट रिसेप्टर्स या इम्युनोग्लोबुलिन superfamily के सदस्यों selectin द्वारा मध्यस्थता है जो एक रोलिंग कदम से गुजरना. यह जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) endothelial glycocalyx पर प्रस्तुत chemokines से सक्रिय हो श्वेतकोशिका सतह पर व्यक्त की अनुमति देता है. इस श्वेतकोशिका सतह पर एक 'उच्च आत्मीयता' राज्य के लिए integrin पुष्टि की परिवर्तन की ओर जाता है और गिरफ्तारी और endothelium के लिए फर्म आसंजन. फर्म आसंजन तब पोत पर श्वेतकोशिका का आकार परिवर्तन और रेंगने द्वारा पीछा किया जाता है. अंतिम चरण paracellular या transcellular मार्गों के माध्यम से हो सकता है, जो endothelial monolayer, के माध्यम से पुनर्जन्म है.
Multistep आसंजन झरना का वर्णन करते समयशरीर के भीतर श्वेतकोशिका भर्ती की सामान्य प्रक्रिया अंग विशिष्ट मतभेद हैं. जिगर में श्वेतकोशिका भर्ती के बहुमत भर्ती आम तौर पर बाद केशिका venules 2 के भीतर होता है, जहां अन्य अंगों के विपरीत यकृत sinusoids के भीतर होता है. यकृत sinusoids एक कम कतरनी वातावरण हैं और ल्यूकोसाइट स्वतंत्र 2 selectin है जो आसंजन दृढ़ करने से पहले एक संक्षिप्त tethering कदम से गुजरना. ये चैनल टूटनेवाला है और fenestrae, व्यास में खुले pores 100-200 एनएम होता है जो यकृत sinusoidal अन्तःचूचुक से लाइन में खड़ा है, और एक तहखाने झिल्ली 3 कमी कर रहे हैं. मानव यकृत sinusoidal अन्तःचूचुक भर श्वेतकोशिका भर्ती मध्यस्थता कि आणविक तंत्र elucidating अंग सूजन यकृत रोगों के लिए विशेष चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान कर सकता है.
फ्लो आसंजन assays श्वेतकोशिका भर्ती का अध्ययन करने में आवश्यक उपकरण हैं. वे अनुमति श्वेतकोशिका recru का पुनर्निर्माणअच्छी तरह से परिभाषित बलों के तहत आसंजन का विश्लेषण करने के लिए कतरनी तनाव की उपस्थिति में itment. परख के लिए सबसे अक्सर इस्तेमाल सुसंस्कृत endothelial monolayers या शुद्ध substrates के लिए अध्ययन श्वेतकोशिका आसंजन है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवाह कक्षों दो फ्लैट सतहों के बीच लामिना का प्रवाह की शर्तों के तहत कोशिकाओं छिड़कना और फिर एक माइक्रोस्कोप 4 पर आसंजन की गतिशील प्रक्रिया कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है. पिछला समूहों कुछ चिपकने वाली बातचीत केवल प्रवाह के तहत जगह ले दिखा दिया है कि और स्थिर assays 5,6 में अध्ययन नहीं किया जा सकता.
हम यकृत sinusoids पुनरावृत्ति और कम कतरनी तनाव की शर्तों के तहत श्वेतकोशिका भर्ती अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. प्राथमिक मानव HSEC microslides और ल्यूकोसाइट में सुसंस्कृत हैं तो यकृत sinusoids भीतर कतरनी तनाव को पुन: पेश करने के लिए गणना प्रवाह की दर पर इस monolayer अधिक perfused किया जा सकता है. कतरनी तनाव OPP के रूप में एक सतह के समानांतर या स्पर्शरेखा लागू किया जाता है कि एक तनाव हैसीधा है, जो सामान्य तनाव को osed. एक सीमा के साथ बढ़ रहा है कि कोई भी तरल पदार्थ है कि सीमा पर एक कतरनी तनाव लागू होगा. कतरनी तनाव लिम्फोसाइट स्थानांतरगमन 7 का एक अनिवार्य घटक होना दिखाया गया है. इन शर्तों के तहत आसंजन झरना के प्रत्येक चरण चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं. यह विधि पारंपरिक आसंजन अणुओं 8 के अध्ययन, chemokines और केमोकाइन रिसेप्टर्स 9-11 की भूमिका, और संवहनी आसंजन प्रोटीन -1 (VAP-1 के रूप में असामान्य आसंजन अणुओं सहित जिगर के भीतर ल्यूकोसाइट की भर्ती में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि की अनुमति दी है ) 8,12 और आम लसीका और संवहनी endothelial रिसेप्टर 1 (चालाक -1) 13. इस परख हमारे समूह के प्रकाशनों के कई में उल्लेख किया गया है, whilst अपने विवरण संक्षिप्त किया गया है और हम समस्या निवारण में मदद मिलेगी और तकनीकी त्रुटियों को रोकने के लिए कदम गाइड द्वारा एक विस्तृत कदम प्रदान करने के लिए इस अवसर ले लिया है जब प्रयासपरख रही है. इसके अलावा, हम हाल ही में कतरनी तनाव में सही परिवर्तन की अनुमति देता है जो microslide कक्षों की सोर्सिंग को बदल दिया है. हम यह अन्य endothelial और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को परख की प्रयोज्यता broadens विश्वास करते हैं. निम्न विधि मानव यकृत sinusoidal endothelial कोशिकाओं और परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों के साथ एक प्रवाह आधारित आसंजन परख से बाहर ले जाने के लिए तैयार करने और तकनीक का वर्णन है.
सफलतापूर्वक एक प्रवाह परख प्रदर्शन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम endothelial कोशिकाओं की एक स्वस्थ और मिला हुआ monolayer पूर्व प्रवाह आसंजन परख करने के लिए तैयार है कि यह सुनिश्चित करना है. प्राथमिक endothelial कोशिकाओं संस्कृति के लिए मुश्किल और संवर्धन तरीकों में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हो सकता है. यह 1) प्रवाह कक्षों पर्याप्त रूप से और समान रूप से एक monolayer में endothelial कोशिकाओं के साथ लेपित हैं कि महत्वपूर्ण है, HSEC के लिए हम चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार मैं उपयोग करें, लेकिन यह अन्य endothelial आबादी के लिए अलग हो सकता है, 2) मध्यम संस्कृति के लिए, सेल प्रकार के लिए उपयुक्त है HSEC हम प्रोटोकॉल अनुभाग में हमारी पूरी मध्यम वर्णन किया है. अन्य महत्वपूर्ण कदम कतरनी तनाव के शारीरिक स्तर को प्रतिबिंबित करने के लिए उचित दर पर सिरिंज पंप स्थापित करने में शामिल हैं.
प्रवाह परख के दौरान यह endothelial monolayer नुकसान या endothelial सतह से प्रतिरक्षा कोशिकाओं पट्टी कर सकते हैं जो प्रवाह सर्किट के भीतर हवाई बुलबुले को रोकने के लिए आवश्यक है. यह एन से रोका जा सकता हैसभी सिलिकॉन टयूबिंग और एडेप्टर सभी हवाई बुलबुले हटा दिया है और मीडिया का उपयोग करने से पहले prewarmed रहे हैं कि कर रहे हैं कि, पिछले कनेक्शन को धोने बफर के साथ perfused हैं कि suring. यह एक तरल / तरल इंटरफेस कनेक्शन के दौरान वहाँ है कि बहुत महत्वपूर्ण है microslide पर बंदरगाहों के लिए एडेप्टर जोड़ने पर किसी भी हवा है, तो यह सिरिंज वापसी के दौरान endothelial monolayer को बाधित करेगा जो प्रणाली के भीतर एक हवा खाई बनेगी कदम. सिरिंज बैरल में श्वेतकोशिका समाधान कोशिकाओं इस प्रकार प्रयोग भर में एक निरंतर सेल घनत्व को बनाए रखने, व्यवस्थित नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए नियमित रूप से आंदोलन की जरूरत है.
रिकॉर्डिंग चरणों के दौरान यह endothelial परत की छवि को पर्याप्त रूप से ध्यान केंद्रित किया और सटीक ऑफ़लाइन विश्लेषण की अनुमति के लिए स्पष्ट है यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और उस प्रवाह परख (पोस्ट श्वेतकोशिका सांस में) के दूसरे चरण के दौरान कहा कि काफी समय से धोने बफर के दौरान छोड़ दिया है रिकॉर्डिंग से पहले चरण के लिए सुनिश्चित करें कि recommenced हैसभी nonadherent ल्यूकोसाइट को हटा रहे हैं. इसी तरह यह संकीर्ण केशिकाओं में प्रवाह पैटर्न के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जो कोशिकाओं के नुकसान को रोकने के लिए और भी चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत बड़ा पक्षपाती ल्यूकोसाइट से भेदभाव करने के लिए कठिन हो सकता है उचित घनत्व की एक monolayer में endothelial कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. हम मानव यकृत sinusoidal endothelial कोशिकाओं के लिए इष्टतम बोने घनत्व का वर्णन किया है, लेकिन यह अलग endothelial आबादी और प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकते हैं.
महत्वपूर्ण प्रगति intravital माइक्रोस्कोपी के साथ पशु मॉडल में श्वेतकोशिका भर्ती अध्ययन में किया गया है. प्रवाह आसंजन परख विधि का प्रमुख लाभ श्वेतकोशिका भर्ती प्राथमिक मानव endothelial कोशिकाओं के साथ एक बाइनरी सिस्टम में अध्ययन किया जा सकता है. इसके अलावा, इन मुलाकातों कतरनी तनाव के शारीरिक प्रासंगिक स्तरों के अधीन अध्ययन किया जा सकता है. Differenc वहाँ हो सकता है के रूप में यह मानव सेलुलर सिस्टम के साथ पशुओं में intravital अध्ययन के निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण हैप्रजातियों के बीच endothelial गुणों में ते. प्रवाह परख की सीमाओं में से एक श्वेतकोशिका भर्ती endothelial monolayer के एक कोशिकीय वातावरण में अध्ययन किया जा रहा है. ल्यूकोसाइट अन्तःचूचुक भर में पालन किया और transmigrated एक बार इसके अलावा वे पृथक और नीचे की ओर प्रक्रियाओं के अधीन किया जा करने के लिए पर्याप्त संख्या में मौजूद में नहीं हो सकता है.
इन सीमाओं के बावजूद, प्रवाह आसंजन परख में महारत हासिल हो जाने के बाद यह श्वेतकोशिका आसंजन झरना के आगे के विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए विकसित की है और एक बहुकोशिकीय पर्यावरण पुनरावृत्ति करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. एकल खेतों और ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के इस्तेमाल का लम्बे समय तक रिकॉर्डिंग ल्यूकोसाइट की रेंगने व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा प्रवाह परख के पूरा होने पर microslides अधिक विस्तार में आसंजन और स्थानांतरगमन अध्ययन करने के लिए लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी और Immunofluorescent लेबलिंग का उपयोग कर पूछताछ की जा सकती है. इसके अतिरिक्त, हम पहले से विकसित किया हैबह ल्यूकोसाइट hepatocytes की मौजूदगी से वातानुकूलित यकृत अन्तःचूचुक के साथ बातचीत कर सकता है, जहां इन विट्रो मॉडल एड. यह परख भी ल्यूकोसाइट की subpopulations अध्ययन करने के लिए विकसित किया जा सकता है: हमारे समूह ऐसे विनियामक टी कोशिकाओं बी कोशिकाओं और जिगर में घुसपैठ ल्यूकोसाइट रूप कैंपेन्स के साथ अध्ययन का प्रदर्शन किया गया है.
इन अध्ययनों प्रवाह आसंजन परख मानव प्रणालियों में सामान्य और अंग विशेष श्वेतकोशिका भर्ती अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है कि सबूत हैं.
The authors have nothing to disclose.
एसएस एक वेलकम ट्रस्ट कार्यक्रम अनुदान से एक वेलकम ट्रस्ट इंटरमीडिएट क्लीनिकल फैलोशिप, CW द्वारा वित्त पोषित है.
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |