Leucocyte rekrytering till levern sker inom de specialiserade kanaler lever sinusoider som är kantade av unika hepatiska sinusformade endotelceller. Faskontrastmikroskopi av leukocyt rekrytering över mänsklig leversinus endotel under förhållanden av fysiologiska skjuvspänning kan underlätta att klarlägga de molekylära mekanismer som ligger bakom denna process.
Leucocyte infiltration i human levervävnad är en gemensam process i alla vuxna inflammatoriska leversjukdomar. Kronisk infiltration kan driva utvecklingen av fibros och progression till cirros. Att förstå de molekylära mekanismer som förmedlar leukocyt rekrytering till levern kunde identifiera viktiga terapeutiska mål för leversjukdom. Nyckel interaktion under leukocyt rekrytering är det av inflammatoriska celler med endotel under förhållanden av skjuvspänning. Rekryteringen till levern sker inom de låga skjuvning kanaler lever sinusoider som kantas av leversinusformade endotelceller (Hsec). Villkoren inom lever sinusoider kan rekapituleras genom perfusion leukocyter genom kanaler kantade av humana Hsec monolager vid specifika flöden. Under dessa betingelser leukocyterna undergå en kort tjudra steg följt av aktivering och fast vidhäftning, följt av en krypande steg och efterföljande transmigration över endotelskiktet. Med hjälp av faskontrastmikroskopi, kan varje steg i denna "vidhäftning kaskad" visualiseras och registreras därefter offline analys. Endotelceller och leukocyter kan förbehandlas med hämmare för att fastställa betydelsen av specifika molekyler under denna process.
Det är nu väl etablerat att leukocyter rekrytering i allmänhet följer ett paradigm för den flerstegs vidhäftning kaskad 1. Detta involverar infångning av leukocyter från att strömma blod av endotelceller som bekläder kärlväggen. Inledningsvis leukocyter genomgå en rullande steg som förmedlas av selektin receptorer eller medlemmar av immunoglobulinsuperfamiljen. Detta gör G-proteinkopplade receptorer (GPCR) som uttrycks på leukocyter yta för att aktiveras av kemokiner som presenteras på den endoteliala glykokalyx. Detta leder till förändring av grin bekräftelse till en "hög affinitet" tillstånd på leukocyt ytan och arrestera och fast vidhäftning till endotelet. Firm vidhäftning följs sedan av formförändringar och genomsökning av leukocyt på fartyget. Det sista steget är transmigration genom endothelial monolager, vilket kan ske via paracellulär eller transcellulär vägar.
Medan den flerstegs vidhäftning kaskad beskrivas allmänna mekanismen för leukocyt rekrytering i kroppen finns det organspecifika skillnader. I levern majoriteten av leukocyter rekrytering inträffar inom de hepatiska sinusvågor, i motsats till andra organ där rekrytering uppträder i allmänhet inom de postkapillära venoler 2. De leversinuskurvor är en låg skjuvning miljö och leukocyter genomgår en kort tjudra steg före fast adhesion som selektin oberoende 2. Dessa kanaler är kantade av det hepatiska sinus endotelet som är diskontinuerlig och innehåller fenestrae, öppna porer 100-200 nm i diameter, och saknar ett basalmembran 3. Klargöra de molekylära mekanismer som förmedlar leukocyt rekrytering över mänsklig leversinus endotel kunde identifiera organspecifika terapeutiska mål för inflammatoriska leversjukdomar.
Flödesvidhäftnings analyser är viktiga verktyg i att studera leukocyt rekrytering. De tillåter återuppbyggnaden av leukocyt recruitment i närvaro av skjuvspänning för att analysera vidhäftning under väl definierade krafter. Den vanligaste användningen för analysen är studiet leukocyt adhesion till odlade endoteliala monoskikt eller renade substraten. Kommersiellt tillgängliga flödeskammare används för att BEGJUTA celler under förhållanden med laminärt flöde mellan två plana ytor och sedan visualisera den dynamiska processen för vidhäftning på ett mikroskop 4. Tidigare grupper har visat att vissa lim interaktioner bara ske under flöde och kan inte studeras i statiska analyser 5,6.
Vi har använt denna teknik för att sammanfatta de lever sinusoider och studera leukocyt rekrytering under förhållanden med låg skjuvspänning. Primär human Hsec odlas i microslides och leukocyter kan därefter perfusion över detta monoskikt vid en flödeshastighet beräknas för att återge den skjuvspänning inom hepatic sinusoids. Skjuvspänningen är en stress som tillämpas parallellt eller tangerar en yta som opposed till normalspänning, som är vinkelrät. Varje vätska som rör sig längs en gräns kommer att utöva en skjuvspänning på denna gräns. Shear stress har visat sig vara en viktig del av lymfocyter transmigration 7. Under dessa förhållanden är varje steg av vidhäftning kaskad kan visualiseras genom faskontrastmikroskopi. Denna metod har gjort det viktiga insikter i rekryteringen av leukocyter i levern inklusive studiet av konventionella adhesionsmolekyler 8, rollen av kemokiner och kemokinreceptorer 9-11, och atypiska adhesionsmolekyler, såsom vaskulär adhesion protein-1 (VAP-1 ) 8,12 och gemensam lymfatisk och vaskulär endotel receptor-1 (CLEVER-1) 13. Även denna analys har nämnts i flera av vår grupps publikationer har sin beskrivning varit korta och vi har tagit tillfället i akt att ge en detaljerad steg för steg guide för att hjälpa till vid felsökning och förebygga tekniska fel vid försökning vid analysen. Dessutom har vi nyligen bytt inköp av Microkammare som möjliggör exakta förändringar i skjuvspänning. Vi tror att detta breddar tillämpningen av analysen för att andra endoteliala och immunceller. Följande metod beskriver förberedelserna och tekniken för att utföra en flödesbaserad vidhäftningsanalys med humana leversinusformade endotelceller och perifera blodlymfocyter.
Det mest kritiska steget för att framgångsrikt utföra en assay flöde är att säkerställa att en sund och sammanflytande monoskikt av endotelceller är redo före vidhäftningen flödesanalys. Primära endotelceller kan vara svårt att odla och känsliga för förändringar i odlingsmetoder. Det är viktigt att en) flödeskammare på ett adekvat och likformigt belagd med endotel-celler i ett monoskikt, för Hsec vi använder råttsvanskollagen typ I men detta kan variera för andra endoteliala populationer, 2) odlingsmedium som är lämpligt för celltypen, för Hsec vi beskrivit vår komplett medium i protokollet avsnittet. Andra viktiga steg inkluderar att ställa in sprutpumpen på lämplig takt för att återspegla fysiologiska nivåer av skjuvspänning.
Under analysflödet är det nödvändigt att förhindra att luftbubblor i flödeskrets, som kan skada den endoteliala monoskiktet eller remsa immunceller från endotelytan. Detta kan förhindras genom ensuring att alla silikonslangar och adaptrar perfusion med tvättbuffert före kopplingen, att alla luftbubblor avlägsnas och att medierna är förvärmt före användning. Vid anslutning av adaptrar till portarna på mikros är det mycket viktigt att det finns en vätska / vätskegränssnitt under anslutning, om det finns någon luft då detta kommer att bilda en luftspalt i systemet som kommer att störa endothelial monolager under sprutan tillbakadragande steget. Den leukocyter lösningen i sprutan fat behöver regelbunden agitation för att se till att cellerna inte nöja sig, därmed upprätthålla en konstant celltäthet under hela försöket.
Under inspelningssteg är det viktigt att se till att bilden av endotelskiktet är tillräckligt fokuserad och tydlig för att möjliggöra noggrann offline analys, och att under det andra steget i analysflödet (post leukocyter bolus) att tillräckligt med tid finns kvar under tvättbufferten fas innan inspelningen återupptas för att säkerställa attalla icke-vidhäftande leukocyterna avlägsnats. Likaså är det viktigt att använda endotelceller i ett monolager av lämplig densitet för att förhindra förlust av celler som kan störa flödesmönster i trånga kapillärer och även kan vara svåra att skilja från större vidhäftande leukocyter enligt faskontrastmikroskopi. Vi har beskrivit optimal seedning densitet för mänskliga leversinusformade endotelceller, men kan variera mellan olika endothelial populationer och arter.
Betydande framsteg har gjorts i att studera leukocyt rekrytering i djurmodeller med intravital mikroskopi. Den stora fördelen med vidhäftningen flödesanalysförfarande är att leukocyt-rekrytering kan studeras i ett binärt system med primära humana endotelceller. Vidare kan dessa interaktioner studeras under fysiologiska relevanta nivåer av skjuvpåkänning. Det är viktigt att bekräfta resultaten av intravital studier på djur med humana cellulära system eftersom det kan finnas skillnad näres i endothelial egenskaper mellan arter. En av begränsningarna i analysflödet är att leukocyter rekryteringen studeras i en encellig miljö endothelial monolager. Förutom när leukocyter har följt och transmigrated över endotelet de inte kan vara i närvarande i tillräckligt antal för att isoleras och utsätts för nedströmsprocesser.
Trots dessa begränsningar, när vidhäftningen flödesanalysen har bemästrat den kan utvecklas för att utföra ytterligare analys av leukocyt vidhäftning kaskad och anpassad för att sammanfatta en flercellig miljö. Långvarig inspelning av enstaka fält och användning av mjukvara kan användas för att analysera krypande beteende leukocyter. Dessutom efter slutförandet av analysflödet de microslides kan förhöras med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi och immunofluorescens märkning för att studera adhesion och migration mer i detalj. Dessutom har vi tidigare utvecklaed en in vitro-modell där flödande leukocyter skulle kunna interagera med det hepatiska endotel rade genom förekomsten av hepatocyter. Denna analys kan också utvecklas för att studera subpopulationer av leukocyter: vår grupp har utfört studier med undergrupper såsom regulatoriska T-celler, B-celler och lever infiltrerande leukocyter.
Dessa studier är bevis för att vidhäftningen flödesanalysen är ett kraftfullt verktyg för att studera allmänna och organspecifika leukocyt rekrytering i mänskliga system.
The authors have nothing to disclose.
SS finansieras av en Wellcome Trust Intermediate Klinisk Fellowship, CW med Wellcome Trust Programme Grant.
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |