의 리그닌 아래로 규제<em> ZEA 메이스</em> dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해

Summary

이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술은 옥수수 신나 코엔자임에게 낮은 식물 리그닌 함량에 대한 환원 (ZmCCR1) 유전자를 하향 조절하기 위해 사용된다. 세포벽에서 리그닌 다운 규제는 현미경 분석에 의해 시각과 Klason 방법에 의해 정량화된다. 헤미셀룰로오스 및 결정 셀룰로오스의 조성 변화를 분석됩니다.

Abstract

생물 전환 공정 동안에 대안 바이오 에너지 자원 등 목질 계 바이오 매스의 사용을 촉진하기 위하여, 전처리 단계는 세포벽 탄수화물의 접근성을 증가, 식물 세포벽의 구조를 열 필요가있다. 리그닌, 많은 세포 유형의 벽에 존재하는 폴리 페놀의 재료는, 액세스를 효소 심각한 지장으로 알려져있다. 식물의 구조적 완전성과 방어 시스템을 방해하지 않는 레벨로 리그닌 함량의 감소는 바이오 에탄올 생산 비용을 줄이기 위해 가치있는 단계 일 수있다. 이 연구에서는 유전자 이중 가닥 RNA 간섭 기술을 통해 리그닌 생합성 관련 유전자 중 하나, 신나-CoA 환원 (ZmCCR1)를 아래로 조절했다. ZmCCR1_RNAi 구조체는 입자 충격 법을 사용하는 옥수수 게놈에 통합 하였다. 형질 전환 옥수수 식물에없이 야생형 대조군 식물과 비교하여 일반적으로 성장형질 전환 식물의 잎 중간 갈비, 껍질에 갈색 착색의 표시를 제외하고, 바이오 매스의 성장이나 방어 메커니즘으로 terfering 및 줄기. 현미경 분석은 조직 학적 분석과 함께, 잎 후벽 섬유 박형화되었지만 다른 주요 혈관 시스템 구성 요소의 구조 및 크기가 변경되지 않았 음을 밝혔다. 유전자 변형 옥수수의 리그닌 함량은 7-8.7 % 감소시키고, 결정 성 셀룰로오스, 리그닌 함량 감소에 응답하여 증가하고, 헤미셀룰로오스는 그대로 남아 있었다. 분석은 탄소 흐름이 셀룰로오스 생합성에 리그닌 생합성에서 변환 된 경우가 있습니다 나타낼 수 있습니다. 이 문서의 RNAi 기술을 통해 옥수수의 리그닌 함량을 하향 조절하기 위해 사용되는 절차를 묘사하고 세포벽 조성은 세포벽 구조에 대한 변형의 효과를 검증하기 위해 사용 분석한다.

Introduction

목질 계 바이오 매스로부터 바이오 연료 생산으로 인해 미국 ¹ 년에 현재 풍부하는 것이 매우 바람직하며, 농림업 잔기의 지속 수확의 경우, 식품 및 동물 사료의 생산에 사용되는 농경지에 직접 경쟁 할 수있는 능력. 그러나, 현재 미국에서 생성 된 바이오 연료의 주요 소스 옥수수 곡물, 달리, 리그 노 셀룰로오스 물질은 훨씬 더 복잡하고 어려운 무너 뜨리는 수 있습니다. 장쇄 탄수화물, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스, 리그 노 셀룰로오스 성 물질의 발효 중에 당류의 주 소스이며, 식물 세포벽의 많은 유형 또한 리그닌을 포함하고, 병원체의 공격에 대하여 강도, 방위를 제공 phenylpropanoid 중합체 및 소수성 외에 벽을 셀. 식물의 성장과 생존에 필요한 반면, 리그닌은 셀룰로오스 hemicellu의 성공적인 효소 전환에 상당한 장벽을 제공합니다수용성 당을 잃게됩니다. 높은 리그닌 함량을 가진 재료는 일반적으로 (생물학적 변환 경로를 통해) 생물 연료 및 가공 특성 및 제품의 품질에 부정적인 영향으로 인한 펄프와 종이 산업에 모두 덜 바람직한 물질이다. 따라서, 작물 구조 강도 및 방어 시스템을 방해하지 않는 수준에서 리그닌 감소를위한 식물 재료의 유전자 조작은 리그 노 셀룰로오스 바이오 연료와 펄프 및 제지 산업을 모두 생산 비용의 감소를 위해 중요 할 수 있습니다.

옥수수 (ZEA 메이)에서 리그닌 공유 ferulate 및 diferulate 다리를 통해 ² 차 전지 벽에 헤미셀룰로오스에 대한 상호 연결되어 있습니다. 리그닌 헤미셀룰로오스 복잡한 이차 전지 벽에 무결성과 힘을 부여 복잡한 매트릭스를 형성, 수소 결합을 통해 셀룰로오스 미세 섬유에 결합한다. 식물 세포벽의 기계적 강도는 크게 리튬의 유형에 의해 결정된다gnin ^3-5 소단위. 이전의 연구에서, 리그닌 서브 유닛의 비율을 변경하는 효소 소화 ^6-11에 뚜렷한 경향을 보이지 않고있다. 그러나, 리그닌 함량의 감소는 일반적으로 변환 ^{(12, 13)의} 향상을 보여 endocellulases, cellobiohydrolases 및 β-글루코시다 제 ^(14)를 포함하여 가수 분해 효소에 의해 식물 소재의 소화율을 증가시키는 열쇠가 될 수 있습니다.

전 사체의 발현 정도를 조절하는 유전 공학 광범위 작물 특성을 개선하기 위해 실시되었다. 안티센스 ^(15)과 공동 ¹⁶ 억제 기술 등 고급 기술은, 아래로 규제 대상 유전자의 효과적인 수 있습니다. 완전한 유전자 녹아웃은 머리핀 구조 ⁽¹⁷⁾ 인트론 접합 RNA를 암호화하는 유전자의 구조를 사용하여 달성되었습니다. 또한, 이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술, 즉 강력하고 효과적인 유전자 발현 미디어대상으로 성적 저하 또는 번역 탄압 중 하나에 의해 작동 토르, 목표 mRNA의 ^18에 억제 효과의 넓은 범위를 유도하는 강력한 수단을 제공한다. 유전자 침묵 기술은 몇 가지 제한 사항을 보여줍니다. 이러한 기술은 정확하게 전사의 수준을 규제하지 않고는 다른 동종 유전자에 예기치 않은 침묵 효과를 일으킬 수 있습니다.

이 방법에서는, 우리는 dsRNAi은 옥수수 게놈에 생성 수행하는 입자 충격을 채택했다. 현재까지 식물 종의 광대 한 배열이 성공적으로 입자 충격, 아그로 박테 리움 매개 형질 전환, 일렉트로 및 미세 주입 방법을 사용하여 변형되었다. 그것은 가장 효율적이므로 옥수수 유전자 변형에서, 입자 충격 법은 모든 다른 방법에 비해 유리하다. 입자 충격 박테리아에 의존하지 않는, 그래서 방법은 유전자의 유전자, 종의 크기 또는 생물 제약은 무료입니다이긴, 또는 식물의 유전자형. 물리적 유전자 전달체는 높은 변환 효율이 ^19에서 엽록체로 식물 게놈에 및 경우에 따라 도입 될 고 분자량 DNA 복수 유전자를 가능하게한다. 잎 중앙 리브의 혈관계에서 리그닌 환원은 샘플의 지형 및 조성을 조사하기위한 유리한되는 주사 전자 현미경 (SEM)을 통해 가시화 될 수있다.

옥수수 식물, 신나-CoA 환원의 두가 (ZmCCR1 : X98083 및 ZmCCR2 : Y15069) 유전자는 옥수수 게놈 ^(20)에서 발견되었다. 신나 모일-CoA 환원은 신나 밀 알데히드로 hydroxycinnamoyl 아실-CoA 에스테르의 전환을 촉매한다. 유전자가 모든 lignifying 조직에서 발현되어 있기 때문에 우리는이 효소를 하향 조절하는 ZmCCR1 유전자를 선택했다. 시퀀스 것으로 나타났다 때문에 ZmCCR1 유전자의 3 '말단에 523 개의 뉴클레오티드는 dsRNAi가 구성을 위해 선택되었다ZmCCR2들에 비해보다 다양. 따라서, dsRNAi 구조는 정확하게 ^21를 입을 오프 대상 피하고 만 ZmCCR1에 바인딩합니다. ZmCCR1_RNAi 구조체는 세포질 발현 시스템 ImpactVector1.1 태그로 설계 하였다 (1.1 IV) 녹색 조직 특이 적 프로모터를 함유하는, 리불 로스 -1,5 – 비스 포스페이트 카복실 시게나 (RuBisCO).

dsRNAi는 형질 전환 식물에서 생성의 효과를 연구하기 위해, 리그닌 함량을 정량 하였다. Klason (산 불용성) 리그닌 측정 리그닌 ^(22)의 일부를 용해 산성 세제 리그닌 정량 방법에 비해 더 정확한 것으로 알려져있다. 따라서 Klason 리그닌은 형질 전환 된 옥수수 줄기 측정 하였다. 이 절차는 수용성 단당류 ^{(23) 내로} 중합체 탄수화물 변환 두 단계의 산 가수 분해로 구성된다. 가수 매스이어서 산 가용성 및 불용성 분획으로 MATERIALS 및 산 불용성 리그닌은 이전 연구 ^{23, 24에} 따라 측정 하였다. 이상적으로, 리그닌 분석 전에 결과를 방해 할 수있는 가용성 물질을 제거하기 위해, 가수 분해 단계, 잔사에 존재하는 회분을 고려하여 리그닌 잔기의 후 가수 분해 연소에 물, 에탄올 추출을 포함해야한다. 이 단계없이, 시료의 리그닌 함량을 인위적으로 팽창 될 수있다. 전체 방법은 그러나 우리의 실험을 위해 우리가로 인해 테스트에 사용할 재료의 작은 볼륨으로 이러한 단계를 모두 수행 할 수 없습니다, 여기에 제시되어

다른 두 세포벽 성분, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스는 리그닌 하향 조절 된 유전자 변형 옥수수 라인 분석 하였다. 이보고되고있다 그 중 하나를 자신의 페닐알라닌 암모니아 리아제 (PAL) ^25, 4-coumarate 아래로 조절 된 형질 전환 식물 : CoA를 리가 (4CL) ^26, 또는 신나lcohol 탈수소 효소 (CAD)는 ^{27 일} 다른 세포 벽 구조 구성 요소의 증가를 보여줍니다. 우리의 연구에서 첫 단계로서, 결정질 셀룰로오스 Updegraff 방법 ^(28)을 사용하여 측정 하였다. 이 방법은 원래 cellulolytic 세균 및 곰팡이의 다수의 셀룰로오스의 결정을 위해 고안되었다. 헤미셀룰로오스, 리그닌 및 xylosans을 제거하기 위해 간단히, 분쇄 옥수수의 주식은 Updegraff 시약 (물 : 질산 초산)으로 처리 하였다. 결정 셀룰로오스는 완전히 SO ₄ H _2를 추가하여 Saeman 가수 분해를 통해 포도당으로 가수 분해시켰다. 결정 셀룰로오스는 다음 비색 트론 방법 ^29을 사용하여 측정 하였다. 헤미셀룰로오스의 내용이 변경된 경우를 확인하기 위해, 분쇄 된 수피로부터 단당류 추출물을 트리 플루오로 아세트산을 사용하여 가수 분해 알디 톨 아세테이트의 방법을 사용하여 유도체 화 한 후, 가스 크로마토 그래피 (GC) ^(30)에 의해 분석 하였다. 결정에 셀에 대한 자세한 절차lulose 내용과 매트릭스 다당류 성분의 분석은 포스터 등으로 설명되어 있습니다. (2010) ^31.

여기, 우리는 리그닌에 사용되는 절차에 대해 설명 아래 규제의 RNAi 기술, 입자 충격의 변환 및 바이오 연료 발효 설탕에 옥수수 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 가속 해체를위한 리그닌 분석을 통해 옥수수에서.

Protocol

1. ZmCCR1의 아래 규제에 사용 dsRNAi 구문의 준비 dsRNAi 노크 아웃에 ZmCCR1 유전자를 구성하기 위해 필요한 제한 효소 사이트를 포함한 디자인 유전자 특이 적 프라이머. 두 개의 프라이머 세트는 ZmCCR1의 cDNA의 두 조각 세그먼트를 증폭하도록 설계되었습니다 :. 1271 뉴클레오티드 748에서 523 bp의 단편, 그리고 1271 뉴클레오티드 986에서 285 bp의 단편 ZmCCR1의 cDNA는 애리조?…

Representative Results

우리는 RNAi를 통해 옥수수 식물의 리그닌 함량 감소를 보여 주었다. 입자 충격의 변환 방법은 약 30 % trnasformation 효율을 얻었다. ZmCCR1의 유전자 침묵 일관 T0-T2 세대에서 관찰되었다. 리그닌 감소 된 형질 전환 체는 잎 중간 리브, 껍질, 줄기에 갈색 채색을 표시 제외 야생형 옥수수 식물과 유사하게 성장했다. 조직 학적 분석은 돌연변이 라인 옥수수 잎 중앙 리브 (18)의 후벽 섬유의 ?…

Discussion

세포벽 다당류를 심는 미생물 셀룰라아제의 액세스는이 페놀 폴리머 ^(23)와 연결되어있는 정도에 크게 의존한다. 설탕을 발효 될 수있는 목질 계 바이오 매스 변환 속도에 부정적인 식물 secondadry 세포벽에 입금 리그닌 함량과 상관 관계가있다. 이 상관 관계는 그러한 소수성 ^(24), 화학 등의 이질성 리그닌의 물성에 기인 한 정규 가수 분해성 intermonomeric의 부재 ^(25)를 결합하…

Materials

Media	Chemical compositions
N6OSM	4 g/l N6 salts
(Osmotic medium)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6E	4 g/l N6 salts
(Callus induction)	1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	2.76 g/l proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/l casein hydrolysate
	2.5g/l gelrite, pH 5.8.
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6S media	4 g/l N6 salts
(Selection media)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/L sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
Regeneration medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L (1000X) MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	60 g/L sucrose
	3 g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates)
	Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.
Rooting medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	30 g/L sucrose
	3g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates).
Specific materials
Screw-top high pressure tubes	Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ
	Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ
10% Neutral buffered formalin	100ml of formalin
(1 liter)	900ml of ddH2O
	4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate
	(NaH2PO4.H2O)
Equipments
Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)
Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)
Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).
HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)
Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)
Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)
JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)
Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 Moisture Analyzer; Sartorius
Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)