Лигнин вниз-регулирование<em> Zea Mays</em> Через dsRNAi и Класона лигнина анализа
Summary
Двухцепочечной РНК-интерференция (dsRNAi) метод используется для подавляют кукурузы циннамоил коэнзима А редуктазы (ZmCCR1) гена к более низким содержанием лигнина растений. Лигнин понижающая регуляция от клеточной стенки визуализируется с помощью микроскопических анализов и количественно методом Класона. Композиционные изменения в гемицеллюлозы и кристаллической целлюлозы анализируются.
Abstract
Чтобы облегчить использование лигноцеллюлозной биомассы как альтернативного ресурса биоэнергии, во время биологических процессов конверсии, шаг предварительной обработки необходим, чтобы открыть структуру клеточной стенки растений, повышение доступности клеточной стенки углеводов. Лигнин, полифенольных материал присутствует во многих видах клеточной стенки, как известно, значительное препятствие для доступа фермента. Снижение содержания лигнина до уровня, который не мешает структурной целостности и оборонной системы растения может быть важным шагом для снижения затрат на производство биоэтанола. В этом исследовании, мы генетически подавляется один из биосинтеза связанных генов лигнина, циннамоил-КоА редуктазы (ZmCCR1) через мель техники РНК-интерференции двойной. ZmCCR1_RNAi конструкция была интегрирована в геном кукурузы с использованием метода бомбардировки частицами. Трансгенные растения кукурузы росли нормально по сравнению с контрольными растениями дикого типа, без вterfering с ростом биомассы или защитных механизмов, за исключением показа-коричневого окрашивания в трансгенных растений листовых середине ребра, шелухи, и стеблей. Микроскопические анализы, в сочетании с гистологическим анализом, показали, что лист склеренхимные волокна тоньше, но структура и размер других основных компонентов сосудистой системы не было изменено. Содержание лигнина в трансгенной кукурузы был уменьшен на 7-8.7%, содержание кристаллической целлюлозы был увеличен в ответ на сокращение лигнина и гемицеллюлозы осталась неизменной. Анализы может означать, что поток газа можно было бы сместился с биосинтезе лигнина в биосинтезе целлюлозы. Эта статья очерчивает процедуры, используемые для подавляют содержание лигнина в кукурузе через технологии РНК-интерференции, и анализы клеточной стенки композиционное используется для проверки эффекта изменений на структуру клеточной стенки.
Introduction
Производство биотоплива из биомассы лигноцеллюлозы весьма желательно в связи с его нынешней изобилии в США 1, а в случае устойчивого урожая сельскохозяйственных и лесохозяйственных остатков, способность не конкурируют непосредственно для пахотных земель, используемых для пищевой и животного производства кормов. Однако, в отличие зерна кукурузы, которая является основным источником биотоплива в настоящее время, генерируемой в США, лигноцеллюлозные материалы являются значительно более сложными и трудно сломать. В дополнение к длинной цепью углеводов, целлюлозы и гемицеллюлозы, которые являются основными источниками сахара в процессе ферментации лигноцеллюлозных материалов, многих типов клеточных стенок растений также содержат лигнин, в фенилпропаноидного полимера, который обеспечивает прочность, защиту от атаки патогена, и гидрофобность на мобильные стены. В то время как необходимо для роста растений и выживания, лигнин также представляет существенный барьер для успешного ферментативного превращения целлюлозы и hemicelluпроиграть растворимых сахаров. Материалы с высоким содержанием лигнина, как правило, менее желательные материалы как для биотоплива (через пути биологической конверсии) и целлюлозно-бумажной промышленности в связи с негативным воздействием на технологические свойства и качество продукции. Таким образом, генетические манипуляции растительных материалов для сокращения лигнина на уровне, который не вмешивается в растениеводстве структурной прочности и ракетных комплексов может быть важным для снижения издержек производства как для лигноцеллюлозной биотоплива и целлюлозно-бумажной промышленности.
У кукурузы (Zea Mays), лигнин ковалентно сшиты с гемицеллюлозы в первичной клеточной стенки через ферулата и diferulate мостов 2. Лигнин-гемицеллюлоза комплекс связывается с микрофибрилл целлюлозы с помощью водородных связей, образуя сложную матрицу, которая придает целостность и прочность на вторичный клеточной стенки. Механическая прочность клеточных стенок растений во многом определяется типом Lignin субъединиц 3-5. В предыдущих исследованиях, изменяя пропорции лигнина субъединиц не проявляет четкую тенденцию по ферментативной усвояемости 6-11. Тем не менее, снижение содержания лигнина в целом свидетельствуют об улучшении преобразований 12,13 и может быть ключом к повышению усвояемости растительного материала гидролитических ферментов, включая endocellulases, целлобиогидролаз и β-глюкозидаз 14.
Генной инженерии, чтобы регулировать уровень экспрессии транскриптов широко практикуют для улучшения культур черты. Передовые технологии, в том числе анти-смысле 15 и косупрессии 16 технологий, позволяют эффективно понижающей регуляции генов-мишеней. Полный ген нокаут был также достигнут с помощью генных конструкций, кодирующих интронов-сращены РНК со структурой шпильки 17. Кроме того, двухцепочечной РНК-интерференция (dsRNAi) метод, т.е. это мощный и эффективный экспрессии генов СМИтор, который работает либо ориентации деградации транскриптов или перевод репрессии, обеспечивает сильнодействующим средством, чтобы вызвать широкий спектр эффектов подавления на мРНК-мишени 18. Методы молчание генов показать несколько ограничений. Эти методы не точно регулировать уровень транскрипции, и это может привести к неожиданным эффекты глушителей на других гомологичных генов.
В этом методе мы использовали бомбардировку частицами нести dsRNAi конструкции в геном кукурузы. На сегодняшний день, огромный массив видов растений были успешно трансформированы с использованием бомбардировки частицами, Agrobacterium опосредованной трансформации, электропорации и методы микроинъекции. В генетической трансформации кукурузы, метод бомбардировка частицами имеет преимущество перед всеми другими методами, поскольку он является наиболее эффективным. Бомбардировки частицами не зависит от бактерий, поэтому метод свободен от биологических ограничений, таких как размер гена, видов гена илиИгин или завод генотип. Физический трансген система доставки позволяет с высокой молекулярной массы и ДНК множественные гены, которые будут введены в геномов растений и в некоторых случаях в хлоропласты с высокой эффективностью преобразования 19. Снижение лигнин в сосудистой системе листовой середине ребра могут быть визуализированы с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), который является полезным для изучения топографии и состав образцов.
В растений кукурузы, два из редуктазы циннамоил-КоА (ZmCCR1: X98083 и ZmCCR2: Y15069) генов были обнаружены в геном кукурузы 20. Циннамоил-КоА-редуктазы катализирует превращение сложных эфиров hydroxycinnamoyl-КоА в коричные альдегиды. Мы выбрали ген ZmCCR1 вниз-регулировать этот фермент, потому что ген экспрессируется во всех lignifying тканей. В 523 нуклеотиды в конце 3 'гена ZmCCR1 были выбраны для построения, поскольку dsRNAi последовательности, казалось,более разнообразным по сравнению с теми из ZmCCR2. Таким образом, конструкция dsRNAi бы точно связываться только с ZmCCR1, избегая мимо ворот глушителей 21. ZmCCR1_RNAi конструкт был разработан в цитоплазматической экспрессионной системы ImpactVector1.1 тега (IV 1.1), содержащий зеленой ткани специфический промотор, рибулозо-1, 5-бисфосфаткарбоксилазы оксигеназы (RuBisCO).
Для изучения влияния dsRNAi построить на трансгенных растений, содержание лигнина количественно. Класона (кислота нерастворимых в) измерение лигнин, как известно, более точным по сравнению с кислотными методами количественного моющее средство лигнин, который солюбилизации некоторых из лигнина 22. Таким образом, лигнин Класона была измерена в трансгенных стеблей кукурузы. Эта процедура состоит из кислотного гидролиза двухступенчатой который преобразует полимерные углеводы в растворимые моносахаридов 23. Гидролизованный биомасса была затем фракционировали в кислой растворимого и нерастворимого матеALS и кислота нерастворимый лигнин измеряли в соответствии с предыдущих исследований 23,24. В идеале, анализ лигнин должен включать экстракцию водой и этанолом перед стадией гидролиза, с тем, чтобы удалить растворимые материалы, которые могут повлиять на результаты, а также сгорания после гидролиза лигнина остатка с учетом максимального золы, присутствующих в остатке. Без этих шагов, содержание лигнина образца может быть искусственно завышена. Полный метод представлен здесь, однако для наших экспериментов мы не смогли выполнить оба из этих шагов из-за небольшого объема материала, доступного для тестирования
Два других компоненты клеточной стенки, целлюлоза и гемицеллюлоза были также проанализированы в лигнина вниз регулируется трансгенных линий кукурузы. Было сообщено, что трансгенные растения, которые были вниз регулируется в любом их фенилаланиновой аммиак-лиазы (PAL) 25, 4-coumarate: СоА-лигазы (4CL) 26, или коричный вlcohol дегидрогеназы (CAD) 27 показывают рост других структурных компонентов клеточных стенок. В качестве первого шага в наших исследованиях, кристаллическую целлюлозу измеряли с помощью метода Updegraff 28. Этот метод был первоначально разработан для определения целлюлозы в большом количестве клетчатку бактерий и грибков. Вкратце, молотые запасы кукурузы обрабатывали Updegraff реагента (уксусной кислоты: азотная кислота: вода), чтобы удалить гемицеллюлозы, лигнин и xylosans. Кристаллическая целлюлоза была полностью гидролизуется на глюкозу через Saeman гидролиза, добавив H 2 SO 4. Кристаллическую целлюлозу затем анализировали с помощью колориметрического метода, антрон 29. Чтобы проверить, не изменились содержание гемицеллюлозы, моносахаридные экстракты из измельченных стеблей гидролизуют с использованием трифторуксусной кислоты, производные использованием метода алдитол ацетатный, а затем анализировали с помощью газовой хроматографии (ГХ) 30. Подробные процедуры для кристаллического челанализы lulose контент и матричные полисахариды состав описаны в Фостер и др.. (2010) 31.
Здесь мы описываем процедуры, используемые для лигнина вниз регулирования в кукурузе через технологии РНК-интерференции, бомбардировки преобразования частиц и анализа лигнина для ускоренного деконструкции кукурузы лигноцеллюлозной биомассы в ферментации сахаров для биотоплива.
Protocol
Representative Results
Discussion
Доступность микробных целлюлазы к клеточной стенки растений полисахариды в основном зависит от степени, в которой они связаны с фенольных полимеров 23. Обменный курс от лигноцеллюлозной биомассы способный к брожению сахар отрицательно коррелирует с лигнина на хранение в растит?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Микроскопическая изображений проводилось с помощью услуги в Мичиганском государственном университете Центра перспективных микроскопии. Кукуруза каллуса был приобретен у Transformation Center кукурузы из Университета штата Айова. Авторы хотели бы поблагодарить Джеффри Р. Weatherhead из Научно-исследовательской лаборатории МГУ завод для его технической помощи в области анализа углеводов. Это исследование было щедро финансируется Кукуруза маркетинговой программы Мичигана (CMPM) и Консорциумом по исследованию биотехнологии растений (CPBR).
Materials
| Media | Chemical compositions | ||
| N6OSM | 4 g/l N6 salts | ||
| (Osmotic medium) | 1 ml/l N6 vitamin stock | ||
| 2 mg/l 2,4-D | |||
| 100 mg/l myo-inositol | |||
| 0.69 g/L proline | |||
| 30 g/l sucrose | |||
| 100 mg/L casein hydrolysate | |||
| 36.4 g/l sorbitol | |||
| 36.4 g/l mannitol | |||
| 2.5g/l gelrite, pH 5.8 | |||
| Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving | |||
| N6E | 4 g/l N6 salts | ||
| (Callus induction) | 1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock | ||
| 2 mg/l 2,4-D | |||
| 100 mg/l myo-inositol | |||
| 2.76 g/l proline | |||
| 30 g/l sucrose | |||
| 100 mg/l casein hydrolysate | |||
| 2.5g/l gelrite, pH 5.8. | |||
| Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving | |||
| N6S media | 4 g/l N6 salts | ||
| (Selection media) | 1 ml/l N6 vitamin stock | ||
| 2 mg/l 2,4-D | |||
| 100 mg/l myo-inositol | |||
| 0.69 g/L proline | |||
| 30 g/L sucrose | |||
| 100 mg/L casein hydrolysate | |||
| 36.4 g/l sorbitol | |||
| 36.4 g/l mannitol | |||
| 2.5g/l gelrite, pH 5.8 | |||
| Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving | |||
| Regeneration medium | 4.3 g/L MS salts | ||
| 1 ml/L (1000X) MS vitamin stock | |||
| 100 mg/L myo-inositol | |||
| 60 g/L sucrose | |||
| 3 g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates) | |||
| Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving. | |||
| Rooting medium | 4.3 g/L MS salts | ||
| 1 ml/L MS vitamin stock | |||
| 100 mg/L myo-inositol | |||
| 30 g/L sucrose | |||
| 3g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates). | |||
| Specific materials | |||
| Screw-top high pressure tubes | Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ | ||
| Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ | |||
| 10% Neutral buffered formalin | 100ml of formalin | ||
| (1 liter) | 900ml of ddH2O | ||
| 4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate | |||
| (NaH2PO4.H2O) | |||
| Equipments | |||
| Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States) | |||
| Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany) | |||
| Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States). | |||
| HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States) | |||
| Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States) | |||
| Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England) | |||
| JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan) | |||
| Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL | |||
| MA35 Moisture Analyzer; Sartorius | |||
| Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States) |
References
- Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. Lignin-ferulate cross-links in grasses – Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins. Carbohydrate research. , 275-178 (1995).
- Park, S. -. H. . Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , (2011).
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
- Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).
- Dien, B. S., et al. Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition. Bioresource technology. , 102-6486 (2011).
- Fu, C. X., et al. Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass. Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).
- Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability. Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnology for biofuels. 3, (2010).
- Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. Designed for deconstruction–poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production. The New phytologist. 194, 91-101 (2012).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).
- Chen, F., Dixon, R. A. Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production. Nature. 25, 759-761 (2007).
- Ziebell, A., et al. Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin. The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).
- Park, S. -. H., et al. The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars. Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).
- Mol, J. N., et al. Regulation of plant gene expression by antisense RNA. FEBS letters. 268, 427-430 (1990).
- Adamo, A., et al. Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).
- Smith, N. A., et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. 407, 319-320 (2000).
- Park, S. -. H., et al. Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels. Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).
- Altpeter, F., et al. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).
- Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes. Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).
- Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).
- Hatfield, R. D., Jung, H. -. J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures. J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).
- Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. Laboratory Analytic Procedure. , (2008).
- Bate, N. J., et al. Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).
- Hu, W. J., et al. Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature. 17, 808-812 (1999).
- Lapierre, C., et al. Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins. Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).
- Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature. 7, 1590-1607 (2012).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates. J. Vis. Exp. (e1837), (2010).
- Department of Agronomy, Iowa State University. Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants. , (2005).
- Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana. The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).
- Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses. Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).
