Kvantificering af Breast Cancer Cell invasiv Ved hjælp af en tre-dimensionel (3D) Model
Summary
Denne artikel indeholder detaljerede metoder til anvendelse af tre-dimensionelle (3D) assays at kvantificere brystkræft celle invasion. Konkret har vi diskutere de procedurer, der kræves for at oprette sådanne assays, kvantificering og dataanalyse, samt metoder til at undersøge tabet af membranintegritet der opstår, når celler invadere.
Abstract
Det er nu velkendt, at den cellulære og væv mikromiljø er kritiske regulatorer, der påvirker tumor initiering og progression. Desuden er den ekstracellulære matrix (ECM) er påvist at være en kritisk regulator af celle adfærd i kultur og homeostase in vivo. Den nuværende tilgang til dyrkning af celler på to-dimensionelle (2D), plastoverflader resulterer i forstyrrelse og tab af komplekse interaktioner mellem celler og deres mikromiljø. Gennem brug af tre-dimensionelle (3D) kultur assays, er betingelserne for celle-mikromiljø vekselvirkning etableret ligner in vivo mikromiljø. Denne artikel giver en detaljeret metode til at vokse brystcancerceller i en 3D-basalmembran proteinmatrix, eksemplificering potentiale 3D kultur i vurderingen af celleinvasion i det omgivende miljø. Desuden diskuterer vi, hvordan disse 3D assays har potentiale til at undersøge tabet af signalering Molecbundmoduler der regulerer epitelial morfologi ved immunfarvning procedurer. Disse undersøgelser hjælpe til at identificere vigtige mekanistiske detaljer i de processer, der regulerer invasion, der er nødvendige for spredningen af brystkræft.
Introduction
Migration og invasion af individuelle eller kollektive celler er to kendetegnende for kræft, og der kræves til metastatisk spredning af kræftceller 1-4. Evnen af cancerceller til at indlede metastase afhænger af deres evne til at migrere og invadere de tilgrænsende væv ved hjælp af invadopodia at nedbryde basalmembranen af cellerne. Invadopodia er dynamiske actin-rige matrixnedbrydning fremspring, der muliggør nedbrydning af den ekstracellulære matrix gennem frigivelse af matrix-nedbrydende proteaser 5. Kræftcelle invasion involverer nedbrydningen af matrix efterfulgt af migrationen af de kræftceller, og det er ledsaget af en reorganisering af den tre-dimensionelle (3D) matrix miljø 2. Således at trænge gennem matrixen, skal en celle ændre sin form og interagerer med den ekstracellulære matrix (ECM) 2.
Vedligeholdelsen af brystvæv integritet afhænger stramt controlled vævsarkitekturen siden celle-ECM og celle-celle adhæsion vejkryds påvirke genekspression og forstyrrelse af epitelial polaritet kan føre til udbrud af kræft 6-10. Men de fleste in vitro migration og invasion assays, såsom Transwell kammer assays eller sår-scratch analyser er to-dimensionelle (2D) og dermed disse forsømmer de indviklede interaktioner mellem celler og deres tilstødende miljø 3,6,8,11-14. Betydelige morfologiske og funktionelle forskelligheder, herunder variationer i cellulær morfologi, cellulær differentiering, celle-matrix sammenvoksninger og genekspression mønstre er blevet opdaget ved dyrkning af celler i 3D-kulturer, der er almindeligt mangler i 2D-analyser 2,6,8,11. Således anvendelser af 3D-analyser er signifikant fordel i opridset en mere fysiologisk in vivo tilstand, der fører til en bedre oversættelse banebrydende resultater inden for grundforskning til klinikken 6-10. Det bør imidlertid bemærkes,På trods af de mange fordele, der opnås ved anvendelse af 3D-kulturer, kan denne model ikke fange alle de komplekse in vivo tumor mikromiljø, der omfatter forskellige celletyper. Det er imidlertid muligt at inkorporere stromaceller i 3D modeller (for eksempel fibroblaster, leukocytter og makrofager) til at studere virkningen af tumor-stroma interaktioner på kræft celleadhæsion og invasion 15-17.
Breast epitelceller i kultur vokser mest effektivt, når ECM-proteiner, såsom laminin og kollagen er til stede. Med dette kendte, har et kommercielt tilgængeligt matrixblandingen stammer fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murin tumor og er kendt som Matrigel basalmembranmatrix 2,8. Der er etableret en række teknikker til at dyrke epitelceller som 3D kolonier i basalmembranmatrix 2,8. 3D basalmembranmatrix model er effektiv til oprettelse af både maligne og non-maligne bryst cellervækst, der ligner det, der sker i in vivo miljø 18,19. MCF10A celler er ikke-maligne brystepitelceller celler. Når der dyrkes i basalmembranmatrix, udviser disse celler in vivo træk af normale bryst celler og underkastes kontrolleret celleproliferation, celledifferentiering polarisering, og apoptose at etablere lumen plads 8,12,20. Desuden forekomsten af cellekerner fra MCF10A celler danner acini i 3D kulturer mere ligner dem af brystepitelceller celler i væv end dem dyrket i monolag 21.. Undersøgelser foretaget af Bissell og kolleger var de første til at afsløre, at maligne bryst celler kan skelnes fra ikke-maligne bryst celler, når de dyrkes i en laminin-rige omgivelser, da de maligne celler vise en meget uorganiseret fænotype, øget spredning, nedsat celle-til- celleadhæsion, forøget ekspression af mesenchymale markører og en stigning i antallet af invasive struktur dannet 3,6,22.
Abnormiteter i cellen miljø kan påvirke tumordannelse 20. 3D kultur metode kan bruges til effektivt at studere kommunikation, der opstår mellem tumorceller og deres omgivende miljø og bestemme, hvordan protein udtryk påvirkninger såsom kommunikation 14,20,21,23. Denne artikel giver en detaljeret metode til at vokse MDA-MB-231 brystkræftceller i 3D kulturer at analysere invasiv og undersøge tabet af epitelial morfologi ved hjælp af en epitelial markør laminin, en komponent af cellen basalmembran 18,19,24, 25.. De detaljerede procedurer giver evnen til præcist og reproducerbart kvantificere stellate (invasive) strukturdannelse af enhver invasiv cancer celle og er ikke begrænsende til de fælles brystcancercellelinjer (såsom MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 eller T47D ). Således kan denne analyse fungere som en platform for at vurdere, hvordan protein-ekspression i celler eller behandling med pro-eller anti-invasive forbindelser regulerer ekstracellulær matrix nedbrydning ved enkelt eller flere celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Udviklingen af 3D cellekultur teknikker har tilladt forskerne at studere omdannelsen af bryst epitelceller, giver os mulighed for at visualisere de dramatiske morfologiske ændringer. Udover at analysere celle invasion, kan enkelt-eller flercellede brystepitelceller sphæroider bruges til at vurdere ændringer i cellulær adhæsion, spredning, størrelse og basal-apikal polaritet. I modsætning til tidligere beskrevne metoder, hvor cellerne er overlejret med ECM 8, vores metode integrerer celler i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1.5 mL tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 mL Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 mL filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 uL filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 uL filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg⁄mL Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/mL |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 mL pipet | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
