Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell
Summary
Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden für die Verwendung von dreidimensionalen (3D-) Assays auf Brustkrebszellinvasion zu quantifizieren. Insbesondere diskutieren wir die Verfahren erforderlich, um solche Tests einrichten, Quantifizierung und Datenanalyse, sowie Methoden, um den Verlust der Membranintegrität, die bei Zellen eindringen tritt zu untersuchen.
Abstract
Es ist nun gut bekannt, daß die Zell-und Gewebemikroumgebung kritische Regulatoren beeinflussen Tumor Initiierung und Progression. Darüber hinaus ist die extrazelluläre Matrix (ECM) wurde gezeigt, dass ein kritischer Regulator des Zellverhaltens in Kultur und in vivo-Homöostase. Der aktuelle Ansatz der Kultivierung von Zellen auf zweidimensionalen (2D), Kunststoffoberflächen führt zu der Störung und Verlust der komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung. Durch die Verwendung von dreidimensionalen (3D) Kultur-Assays werden die Bedingungen für die zellMikro Wechselwirkung fest ähnlich der in vivo-Mikroumgebung. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Methode zur Brustkrebs-Zellen in einem 3D-Basalmembran Proteinmatrix wachsen Ausführungs das Potential der 3D-Kultur in der Beurteilung der Zellinvasion in die Umgebung. Darüber hinaus diskutieren wir, wie diese 3D-Tests haben das Potenzial, um den Verlust von Signal Mole prüfenModule, die epithelialen Morphologie regulieren durch Immunfärbung Verfahren. Diese Studien unterstützen wichtige mechanistische Details in die Prozesse regulieren Invasion, die Ausbreitung von Brustkrebs erforderlich identifizieren.
Introduction
Migration und Invasion von Einzel-oder Sammelzellen sind zwei Markenzeichen von Krebs und für die Metastasierung von Krebszellen 4.1 erforderlich. Die Fähigkeit von Krebszellen zur Metastasierung initiieren hängt von ihrer Fähigkeit zur Migration und dringen in mit invadopodia die Basalmembran der Zellen beeinträchtigen dem benachbarten Gewebe. Invadopodia sind dynamische Aktin-reichen Matrixabbau Vorsprünge, Abbau der extrazellulären Matrix durch die Freisetzung von Matrix-abbauenden Proteasen 5 zu ermöglichen. Invasion von Krebszellen beinhaltet den Abbau der Matrix, gefolgt von der Wanderung der Krebszellen, und dies wird durch eine Umgestaltung der dreidimensionalen (3D-) Matrix-Umgebung 2 verbunden. So, um durch die Matrix zu durchdringen, eine Zelle muss seine Form zu transformieren und die Interaktion mit der extrazellulären Matrix (ECM) 2.
Die Pflege von Brustgewebe Integrität hängt eng Controlled Gewebearchitektur, da Zell-ECM-und Zell-Zell-Adhäsion Gänge beeinflussen die Genexpression und die Störung der epithelialen Polarität an der Entstehung von Tumoren führen 6-10. Die meisten in vitro die Migration und Invasion von Assays wie Transwell Kammer-Assays oder wundKratzTests sind zweidimensionale (2D) und damit diese die komplizierten Wechselwirkungen zwischen Zellen und der benachbarten Umgebung 3,6,8,11-14 vernachlässigen. Erhebliche morphologische und funktionelle Vielfalt einschließlich Schwankungen in der Zellmorphologie, Zelldifferenzierung, Zell-Matrix-Adhäsionen und Genexpressionsmuster wurden durch Kultivierung von Zellen in 3D-Kulturen, die häufig fehlen in 2D-Assays 2,6,8,11 erkannt. Daher verwendet der 3D-Tests sind deutlich vorteilhaft rekapituliert einen physiologischen Zustand in vivo, was zu einer besseren Übersetzung von bahnbrechenden Erkenntnisse in der Grundlagenforschung in die Klinik 10.06. Es sollte jedoch angemerkt werden,Trotz der vielen Vorteile der Verwendung von 3D-Kulturen gewonnen, kann dieses Modell nicht erfassen alle die Komplexität der in vivo-Tumor-Mikroumgebung, die verschiedene Zelltypen umfasst. Es ist jedoch möglich, Stromazellen in die 3D-Modelle enthalten (z. B. Fibroblasten, Leukozyten und Makrophagen), um den Effekt von Tumor-Stroma-Interaktionen auf Krebszell Adhäsion und Invasion 15-17 studieren.
Brust-Epithelzellen in Kultur effektiv wachsen, wenn ECM-Proteine wie Laminin und Kollagen vorhanden sind. Bei dieser bekannten, wurde eine im Handel erhältliche Mischung aus Matrix Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murinen Tumor abgeleitet und wird als Matrigel Basalmembranmatrix 2,8 bekannt. Eine Anzahl von Techniken wurden eingerichtet, um Epithelzellen als 3D Kolonien in Basalmembranmatrix 2,8 wachsen. Die 3D Basalmembranmatrix Modell ist für die Festlegung sowohl malignen und nicht-malignen BrustzellenWachstum, ähnlich wie in der in vivo Umgebung 18,19 auftritt. MCF10A-Zellen sind nicht-malignen Brustepithelzellen. Wenn in Basalmembranmatrix gewachsen, diese Zellen in vivo Merkmale der normalen Brustzellen zu unterziehen und kontrollierten Zellproliferation, Zellpolarisation und Apoptose, um das Lumen Raum 8,12,20 herzustellen. Ferner das Auftreten von Zellkernen MCF10A-Zellen bilden Acini in 3D-Kulturen mehr ähneln denen von Brustepithelzellen im Gewebe als in Monoschicht 21 gezüchtet. Studien von Bissell und seine Kollegen waren die ersten, zu zeigen, dass bösartige Brustzellen aus nicht-malignen Brustzellen differenziert, wenn in einem Laminin-reichen Umgebung aufgewachsen, da die bösartigen Zellen zeigen eine sehr unorganisiert Phänotyp, erhöhte Proliferation, verringert werden Zell-zu- Zelladhäsion, erhöhte Expression des mesenchymalen Marker und ein Anstieg in der Zahl der invasiven Struktur gebildet 3,6,22.
Fehlbildungen der Zellumgebung kann die Tumorbildung 20 beeinflussen. Die 3D-Kulturverfahren verwendet werden, um wirksam zu untersuchen, die die Kommunikation zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung auftritt, und bestimmen, wie die Proteinexpression Einflüsse wie Kommunikations 14,20,21,23 werden. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Methodik zur MDA-MB-231 Brustkrebszellen in 3D-Kulturen wachsen, um Invasivität zu analysieren und den Verlust der epithelialen Morphologie mit einem epithelialen Marker Laminin, ein Bestandteil der Zell Basalmembran 18,19,24 studieren, 25. Die Verfahren bieten die Möglichkeit, sternförmige (invasiv) Strukturbildung genau und reproduzierbar zu quantifizieren von invasiven Krebszelle und ist nicht auf die gemeinsame Brustkrebszelllinien (z. B. MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, T47D oder Begrenzungs ). Somit kann dieser Test als Plattform zur Bewertung, wie Protein-Expression in Zellen oder Behandlung dienen mit pro-oder anti-invasive Verbindungen regulieren Abbau der extrazellulären Matrix, durch einzelne oder mehrere Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung der 3D-Zellkultur-Techniken konnten die Forscher die Umwandlung von Brust-Epithelzellen, um zu studieren, so dass wir die dramatischen morphologischen Veränderungen zu visualisieren. Neben der Analyse der Zellinvasion, können die Einzel-oder mehrzellige Sphäroide Brustepithelzellen verwendet, um Änderungen in der zellulären Adhäsion, Proliferation, Größe und basal-apikalen Polarität zu beurteilen. Im Gegensatz zu früher berichteten Verfahren, falls die Zellen mit ECM 8 überlagert, b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1.5 mL tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 mL Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 mL filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 uL filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 uL filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg⁄mL Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/mL |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 mL pipet | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
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