एक तीन आयामी (3 डी) मॉडल का उपयोग कर स्तन कैंसर कोशिका invasiveness की मात्रा
Summary
यह लेख स्तन कैंसर सेल आक्रमण यों की तीन आयामी (3 डी) assays के उपयोग के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करता है. विशेष रूप से, हम कोशिकाओं पर आक्रमण होता है कि जब झिल्ली अखंडता के नुकसान की जांच करने के लिए इस तरह के assays स्थापित करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं, मात्रा का ठहराव, और डेटा विश्लेषण, साथ ही तरीकों पर चर्चा की.
Abstract
अब यह अच्छी तरह सेलुलर और ऊतक microenvironment ट्यूमर दीक्षा और प्रगति को प्रभावित महत्वपूर्ण नियामकों हैं कि जाना जाता है. इसके अलावा, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) विवो में संस्कृति और homeostasis में सेल व्यवहार का एक महत्वपूर्ण नियामक होना प्रदर्शित किया गया है. दो आयामी (2 डी) पर संवर्धन कोशिकाओं के वर्तमान दृष्टिकोण, कोशिकाओं और उनके microenvironment के बीच जटिल संबंधों की अशांति और नुकसान में प्लास्टिक की सतहों का परिणाम है. तीन आयामी (3 डी) संस्कृति assays के उपयोग के माध्यम से, सेल microenvironment बातचीत के लिए शर्तों में विवो microenvironment जैसी स्थापित कर रहे हैं. इस अनुच्छेद के आसपास के वातावरण में सेल आक्रमण के आकलन में 3 डी संस्कृति के संभावित exemplifying, एक 3 डी तहखाने झिल्ली प्रोटीन मैट्रिक्स में स्तन कैंसर की कोशिकाओं को विकसित करने के लिए एक विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान करता है. इसके अलावा, हम इन 3 डी assays molec संकेत के नुकसान की जांच करने की क्षमता है कैसे चर्चाप्रक्रियाओं immunostaining द्वारा उपकला आकारिकी कि विनियमित ules. इन अध्ययनों से स्तन कैंसर के प्रसार के लिए आवश्यक आक्रमण के विनियमन प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण यंत्रवत विवरण की पहचान करने के लिए सहायता.
Introduction
प्रवासन और व्यक्तिगत या सामूहिक कोशिकाओं के आक्रमण कैंसर के दो पहचान हैं, और कैंसर की कोशिकाओं को 1-4 से metastatic प्रसार के लिए आवश्यक. मेटास्टेसिस आरंभ करने के लिए कैंसर कोशिकाओं की क्षमता को विस्थापित करने और कोशिकाओं के तहखाने झिल्ली नीचा करने के लिए invadopodia का उपयोग पड़ोसी ऊतकों में आक्रमण करने की उनकी क्षमता पर निर्भर करता है. Invadopodia मैट्रिक्स अपमानजनक proteases 5 की रिहाई के माध्यम से बाह्य मैट्रिक्स की गिरावट सक्षम है कि गतिशील actin युक्त मैट्रिक्स गिरावट protrusions हैं. कैंसर सेल आक्रमण कैंसर कोशिकाओं के प्रवास द्वारा पीछा मैट्रिक्स की गिरावट शामिल है और यह तीन आयामी (3 डी) मैट्रिक्स पर्यावरण 2 के पुनर्गठन के साथ है. इस प्रकार, मैट्रिक्स के माध्यम से प्रवेश करने के लिए, एक सेल अपने आकार को बदलने और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 2 के साथ बातचीत करनी चाहिए.
स्तन के ऊतकों अखंडता के रखरखाव कसकर controlle पर निर्भर करता हैसेल ईसीएम और सेल सेल आसंजन जंक्शनों जीन अभिव्यक्ति और उपकला polarity के विघटन को प्रभावित के बाद से डी ऊतक वास्तुकला कैंसर 6-10 की शुरुआत हो सकती है. हालांकि, इस तरह transwell कक्ष assays या घाव खरोंच assays के रूप में सबसे अधिक इन विट्रो प्रवास और आक्रमण assays के दो आयामी (2 डी) कर रहे हैं और इसलिए इन कोशिकाओं और उनके आसन्न पर्यावरण 3,6,8,11-14 के बीच जटिल बातचीत उपेक्षा. सेलुलर आकारिकी में बदलाव, सेलुलर भेदभाव, सेल मैट्रिक्स adhesions और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न सहित काफी रूपात्मक और कार्यात्मक विविधताओं सामान्यतः 2,6,8,11 assays 2 डी में कमी कर रहे हैं कि 3 डी संस्कृतियों में संवर्धन कोशिकाओं द्वारा खोजा गया है. इस प्रकार, क्लिनिक 6-10 के लिए बुनियादी अनुसंधान में जमीन तोड़ने के निष्कर्षों का एक बेहतर अनुवाद करने के लिए अग्रणी, 3 डी assays के विवो हालत में एक अधिक शारीरिक recapitulating में काफी फायदेमंद होते हैं का उपयोग करता है. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए, 3 डी संस्कृतियों के उपयोग के साथ प्राप्त की कई फायदे के बावजूद, इस मॉडल विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं शामिल है कि vivo में ट्यूमर microenvironment की जटिलताओं के सभी पर कब्जा नहीं कर सकते हैं. हालांकि, यह 3 डी मॉडलों में stromal कोशिकाओं को शामिल करने के लिए संभव है (उदाहरण के लिए, fibroblasts, leukocytes, और मैक्रोफेज) कैंसर कोशिका आसंजन और आक्रमण 15-17 पर ट्यूमर stromal बातचीत के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए.
ऐसे laminin और कोलेजन के रूप में ईसीएम प्रोटीन मौजूद होते हैं जब संस्कृति में स्तन उपकला कोशिकाओं सबसे प्रभावी रूप से हो जाना. यह ज्ञात, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मैट्रिक्स मिश्रण Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) murine ट्यूमर से प्राप्त किया गया है और Matrigel तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 2,8 के रूप में जाना जाता है. तकनीक की संख्या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 2,8 में 3 डी कालोनियों के रूप में उपकला कोशिकाओं को विकसित करने के लिए स्थापित किया गया है. 3 डी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मॉडल घातक और गैर घातक दोनों स्तन सेल की स्थापना के लिए प्रभावी हैविकास, vivo वातावरण 18,19 में क्या हो रहा है जैसी. MCF10A कोशिकाओं गैर घातक स्तन उपकला कोशिकाओं रहे हैं. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में हो, इन कोशिकाओं को सामान्य स्तन कोशिकाओं के vivo लक्षण में प्रदर्शनी और सेल प्रसार, सेल ध्रुवीकरण, और लुमेन अंतरिक्ष 8,12,20 स्थापित करने के लिए apoptosis नियंत्रित गुजरना. इसके अलावा, 3 डी संस्कृतियों में acini बनाने MCF10A कोशिकाओं की कोशिका के नाभिक की शक्ल में और अधिक बारीकी से ऊतक में स्तन उपकला कोशिकाओं के उन monolayer 21 में सभ्य लोगों की तुलना में समान है. बिसेल और उनके सहयोगियों द्वारा अध्ययन घातक कोशिकाओं एक बेहद अव्यवस्थित phenotype प्रदर्शित के बाद से, एक laminin युक्त वातावरण में उगाया प्रसार में वृद्धि हुई है, की कमी हुई जब घातक स्तन कोशिकाओं गैर घातक स्तन कोशिकाओं से भेदभाव किया जा सकता है प्रकट करने के लिए पहले किए गए सेल करने वाली सेल आसंजन, बढ़ mesenchymal मार्करों की अभिव्यक्ति और आक्रामक संरचना की संख्या में वृद्धि 3,6,2 का गठन2.
सेल पर्यावरण की असामान्यताएं ट्यूमर गठन 20 को प्रभावित कर सकते हैं. 3D संस्कृति पद्धति को प्रभावी ढंग से ट्यूमर कोशिकाओं और अपने आसपास के वातावरण के बीच होता है कि संचार का अध्ययन करने और कैसे प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करती है इस तरह के संचार 14,20,21,23 निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह लेख, invasiveness का विश्लेषण करने के लिए 3 डी संस्कृतियों में एमडीए MB-231 स्तन कैंसर की कोशिकाओं को विकसित करने के लिए, और एक उपकला मार्कर laminin, सेल तहखाने झिल्ली 18,19,24 के एक घटक का उपयोग उपकला आकृति विज्ञान के नुकसान का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान करता है 25. विस्तृत प्रक्रियाओं सही और reproducibly किसी भी आक्रामक कैंसर सेल द्वारा तारामय (आक्रामक) संरचना गठन यों तो और ऐसे एमडीए MB-231, Hs578T, MCF 7, या T47D के रूप में आम स्तन कैंसर कोशिका लाइनों (के लिए सीमित नहीं है की क्षमता प्रदान करते हैं ). इस प्रकार, इस परख के साथ कैसे प्रोटीन कोशिकाओं में अभिव्यक्ति या उपचार के मूल्यांकन के लिए एक मंच के रूप में सेवा कर सकते हैं समर्थक या विरोधीआक्रामक यौगिकों एक या कई कोशिकाओं द्वारा, बाह्य मैट्रिक्स गिरावट को विनियमित.
Protocol
Representative Results
Discussion
3 डी सेल कल्चर तकनीक के विकास के शोधकर्ताओं ने हमें नाटकीय रूपात्मक परिवर्तन कल्पना करने की इजाजत दी, स्तन उपकला कोशिकाओं के परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अनुमति दी गई है. सेल आक्रमण का विश्लेषण करने क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1.5 mL tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 mL Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 mL filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 uL filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 uL filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg⁄mL Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/mL |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 mL pipet | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
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