Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello
Summary
Questo articolo fornisce metodologie dettagliate per l'utilizzo di tridimensionali (3D) test per quantificare l'invasione delle cellule di cancro al seno. In particolare, discuteremo le procedure necessarie per configurare tali analisi, quantificazione e analisi dei dati, così come i metodi per esaminare la perdita dell'integrità della membrana che si verifica quando le cellule invadono.
Abstract
È ormai noto che il microambiente cellulare e tissutale sono regolatori critici che influenzano iniziazione e la progressione tumorale. Inoltre, la matrice extracellulare (ECM) è stato dimostrato per essere un regolatore critico del comportamento delle cellule in coltura e omeostasi in vivo. L'attuale approccio di coltura di cellule in bidimensionale (2D), superfici plastiche risultati del disturbo e perdita di complesse interazioni tra le cellule e il loro microambiente. Attraverso l'uso di tridimensionale (3D) saggi di coltura, sono stabilite le condizioni per l'interazione cellula-microambiente simile microambiente in vivo. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per far crescere le cellule del cancro al seno in una matrice 3D di proteine della membrana basale, esemplificando il potenziale della cultura 3D nella valutazione di invasione delle cellule nell'ambiente circostante. Inoltre, si discuterà di come questi test 3D hanno il potenziale per esaminare la perdita di segnalare molecduli che regolano la morfologia epiteliale da immunoistochimica procedure. Questi studi aiutano a identificare importanti dettagli meccanicistici nei processi che regolano l'invasione, necessarie per la diffusione del cancro al seno.
Introduction
Migrazione e l'invasione delle cellule individuali o collettivi sono due caratteristiche di cancro, e necessari per la diffusione metastatica delle cellule tumorali 1-4. La capacità delle cellule di cancro di avviare metastasi dipende dalla loro capacità di migrare e invadere nel tessuto limitrofo utilizzando invadopodia a degradare la membrana basale delle cellule. Invadopodia sono sporgenze degradazione matrice ricca di actina dinamiche che consentono la degradazione della matrice extracellulare attraverso il rilascio di proteasi matrice degradazione 5. Invasione cellula tumorale attraverso la degradazione della matrice e la migrazione delle cellule tumorali e questo è accompagnato da una riorganizzazione dell'ambiente matrice tridimensionale (3D) 2. Così, per penetrare attraverso la matrice, una cella deve trasformare la sua forma e interagire con la matrice extracellulare (ECM) 2.
Il mantenimento dell'integrità del tessuto mammario dipende strettamente controlled architettura tissutale da giunzioni cellula-ECM e cellula-cellula adesione influenzano l'espressione genica e la rottura della polarità epiteliale può provocare l'insorgenza del cancro 6-10. Tuttavia, la maggior vitro migrazione e l'invasione test in quali transwell saggi camera o saggi ferita-graffio sono bidimensionali (2D) e quindi queste trascurano le interazioni complesse tra le cellule e il loro ambiente adiacente 3,6,8,11-14. Diversità morfologiche e funzionali significativi, in particolare le variazioni di morfologia cellulare, differenziazione cellulare, adesioni cellula-matrice e modelli di espressione genica sono stati rilevati da coltura di cellule in colture 3D che sono comunemente carenti in 2D saggi 2,6,8,11. Così, utilizza delle analisi 3D sono significativamente utile ricapitolare in un più fisiologico in condizioni vivo, portando ad una migliore definizione di risultati innovativi nella ricerca di base alla clinica 6-10. Tuttavia, va notato, Nonostante i numerosi vantaggi ottenuti con l'uso di colture 3D, questo modello non può catturare tutte le complessità del microambiente tumorale in vivo che comprende vari tipi di cellule. Tuttavia, è possibile incorporare cellule stromali nei modelli 3D (ad esempio, fibroblasti, leucociti e macrofagi) studiare l'effetto delle interazioni tumore stromale sull'adesione cellula tumorale e invasione 15-17.
Cellule epiteliali mammarie in coltura crescono in modo più efficace quando le proteine ECM come laminina e collagene sono presenti. Con questa nota, una miscela di matrice disponibile in commercio è stata derivata da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumore murino ed è noto come matrice della membrana Matrigel seminterrato 2,8. Un certo numero di tecniche sono state stabilite a crescere cellule epiteliali come colonie 3D a matrice membrana basale 2,8. Il piano seminterrato modello a matrice membrana 3D è efficace per stabilire delle cellule del seno sia maligno e non malignocrescita, simile a quello che sta succedendo nell'ambiente in vivo 18,19. Cellule MCF10A sono cellule epiteliali mammarie non maligne. Quando coltivate in matrice membrana basale, queste cellule mostra a tratti vivo delle cellule normali del seno e sottoporsi controllata la proliferazione cellulare, la polarizzazione delle cellule, apoptosi e per stabilire lo spazio lume 8,12,20. Inoltre, la comparsa di nuclei di cellule di MCF10A formano acini in culture 3D avvicinano maggiormente a quelle delle cellule epiteliali mammarie in tessuto da quelle coltivate in monostrato 21. Gli studi di Bissell e colleghi sono stati i primi a rivelare che le cellule mammarie maligne possono essere differenziate da cellule della mammella non-maligne quando coltivate in un ambiente ricco di laminina, poiché le cellule maligne mostrano un fenotipo altamente disorganizzata, un aumento della proliferazione, diminuzione cellula- adesione cellulare, aumento dell'espressione di marcatori mesenchimali e un aumento del numero di struttura invasiva formano 3,6,22.
Anomalie del l'ambiente cellulare possono influenzare la formazione del tumore 20. Il metodo di coltura 3D può essere usato per studiare efficacemente la comunicazione che avviene tra le cellule tumorali e l'ambiente circostante e determinare come influenze espressione proteica tale 14,20,21,23 comunicazione. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per crescere MDA-MB-231 cellule di carcinoma mammario in culture 3D per analizzare invasività, e per studiare la perdita di morfologia epiteliale utilizzando un marcatore epiteliale laminina, un componente della membrana basale cellulare 18,19,24, 25. Le procedure dettagliate consentono di quantificare con precisione e riproducibile stellato (invasive) formazione della struttura da qualsiasi cellula di cancro invasivo e non è limitante per le linee cellulari del cancro al seno comuni (come MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, o T47D ). Pertanto, questo test può servire come piattaforma per valutare come espressione della proteina in cellule o trattamento con pro o anti-composti invasive regolano la degradazione della matrice extracellulare, da cellule singole o multiple.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo sviluppo delle tecniche di coltura cellulare 3D ha permesso ai ricercatori di studiare la trasformazione di cellule epiteliali mammarie, che ci permette di visualizzare i drammatici cambiamenti morfologici. Oltre ad analizzare invasione cellulare, sferoidi epiteliali mammarie singole o multicellulari possono essere usate per valutare i cambiamenti nella adesione cellulare, la proliferazione, la dimensione e basale-apicale polarità. In contrasto con metodologie precedentemente riportati in cui le cellule vengono sovr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1.5 mL tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 mL Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 mL filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 uL filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 uL filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg⁄mL Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/mL |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 mL pipet | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
