Анализ на боковой линии регенерации в взрослых данио рерио
Summary
Потому что многие данио модели неврологических и не неврологических заболеваний изучаются в взрослых рыб, а не у эмбриона / личинок, мы разработали количественный боковой линии регенеративной анализа, который можно применять взрослым моделей данио заболеваний. Анализ участие разрешение на 1) neuromast и 2) уровнях индивидуальный волосковых клеток.
Abstract
В связи с клинической значимости слуха и нарушения баланса в человеке, модельные организмы, такие как данио были использованы для изучения развития боковой линии и регенерацию. Данио является особенно привлекательным для таких исследований из-за его быстрого времени разработки и высокой регенеративной способностью. На сегодняшний день, данио исследования боковой рекуперации в основном используется рыба из эмбриональных и личиночной стадии из-за меньшего числа невромастов на этих этапах. Это сделало количественный анализ боковой линии регенерации / и или развития легче в более ранних стадиях развития. Потому что многие данио модели неврологических и не неврологических заболеваний изучаются в взрослых рыб, а не в эмбриона / личинок, мы сосредоточены на разработке количественную боковой линии регенеративной анализа в взрослых данио, чтобы анализ был доступен, которые могут быть применены к току взрослые данио модели заболевания. Основываясь на предыдущих исследованиях Ван Trumр и др.. 17, описанной процедуры абляции волосковых клеток во взрослой мексиканской слепой пещерной рыбы и рыбок данио (Danio рерио), наш анализ был разработан, чтобы позволить количественное сравнение между контрольной и экспериментальной групп. Это было достигнуто путем разработки регенеративную neuromast стандартную кривую на основе процента neuromast повторному течение периода с 24 часами времени после некроз гентамицина-индуцированной волосковых клеток в определенной области боковой линии. Анализ также была разработана, чтобы позволить расширение анализа на индивидуальном уровне волосковых клеток, когда более высокий уровень разрешения не требуется.
Introduction
Боковая линия (LL) система является механосенсорных орган нашел в обоих рыб и амфибий, который отвечает за слуха, равновесия, rheotaxis и посреднических поведения, таких как школы и избежании хищника 1-5. Он состоит из кластеров волосковых клеток, окруженных поддерживающих клеток, оба из которых расположены в структурах, называемых невромасты 6. Эти невромасты обычно организованы в вертикальных линий (так называемый стежки) вдоль продольной оси тела и хвоста с некоторыми горизонтальными стежками, наблюдаемых в голове рыбы. У взрослых, невромасты значительно больше, в количестве в пределах стежками по сравнению с эмбриональной или личинок рыб 6. Биомедицинские исследования на рыбках данио уделено влиянию лечения антибиотиками, вызванного шумом травмы, хронической инфекции и др. на волосковых клеток 7,8 в попытке лучше понять их воздействие на человека.
В отличие от большинства позвоночных, т. е.leosts, такие как данио (Danio рерио), имеют способность к регенерации утраченных волосковых клеток. Данио рерио особенно полезны из-за их быстрого времени разработки и высокой регенеративной способностью. Однако на сегодняшний день; данио исследования по разработке боковой линии и / или регенерации в основном использовали эмбриональных и личиночной стадии рыбы в связи с уменьшением числа боковых невромастами линии что облегчает подсчета и анализа 6,9,10.
Однако, как многие данио модели неврологических и не неврологических заболеваний 11-16 изучаются в взрослых рыб, а не личинок, мы сосредоточились на разработке боковой линии регенеративной анализа у взрослых данио, используя гентамицин (аминогликозиды ранее использовались в данио личинок и в последнее время используются с взрослых рыб 17), так что анализ был доступен, которые могут быть применены к текущей взрослых данио моделей заболеваний. В то время как ранее опубликована процедуры Ван Трамп ет др.. 17 создало условия для волосковых клеток абляции в взрослых рыб, они не установить стандартную кривую для neuromast регенерации, который требуется для количественного сравнения между контрольной и экспериментальной групп, таких как при использовании трансгенных линий данио или фармакологически индуцированные болезненных состояний у рыбок данио 18. Поэтому мы последовали процедуры Ван Трамп и др. 17. Для волосковых клеток абляции, но построен на их работу в целях создания стандартного кривую neuromast регенерации, позволяющих исследователям использовать наш данных при сравнении контрольных и экспериментальных групп, таких, как со взрослыми моделями данио болезни . Анализ также была разработана, чтобы позволить расширение анализа в отдельной ячейке волос, когда более высокий уровень разрешения не требуется.
Protocol
Representative Results
Discussion
На основе обширного объема литературы, которая была создана для анализа боковой линии (LL) регенерации в эмбриональном и личинок рыбок данио 8,24,25, цель нашего исследования состояла в разработке количественного анализа для боковой рекуперации у рыбок данио, которые могли бы быть п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gentamicin sulfate solution (50mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| in methanol | |||
| 6 well plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| Image J software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System. | Any aquatic system can be used |
References
- Dambly-Chaudire, C., Sapde, D., Soubiran, F., Decorde, K., Gompel, N., Ghysen, A. The Lateral Line of Zebrafish: a Model System for the Analysis of Morphogenesis and Neural Development in Vertebrates. Biol. Cell. 95 (9), 579-587 (2003).
- Montgomery, J., Carton, G., Voigt, R., Baker, C., Diebel, C. Sensory Processing of Water Currents by Fishes. Phil. Trans. Royal Soc. London B Biol. Sci. 355 (1401), 1325-1327 (2000).
- Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W., Whitfield, T. T. Ototoxin-Induced Cellular Damage in Neuromasts Disrupts Lateral Line Function in Larval Zebrafish. Hearing Res. 284 (1-2), 1-2 (2012).
- Engelmann, J., Hanke, W., Mogdans, J., Bleckmann, H. Hydrodynamic Stimuli and the Fish Lateral Line. Nature. 408 (6808), 51-52 (2000).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguch, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line. PloS One. 7 (5), e36661 (2012).
- Raible, D. W., Kruse, G. J. Organization of the Lateral Line System in Embryonic Zebrafish. J. Comp. Neurol. 421 (2), 189-198 (2000).
- Coffin, A. B., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Extracellular Divalent Cations Modulate Aminoglycoside-Induced Hair Cell Death in the Zebrafish Lateral. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Ma, E. Y., Rubel, E. W., Raible, D. W. Notch Signaling Regulates the Extent of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral Line). J. Neurosci. 28 (9), 2261-2273 (2008).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and Fins: Non-Mammalian Models for Hair Cell Regeneration. Brain Res. 1277, 12-23 (2009).
- Bibliowicz, J., Tittle, R. K., Gross, J. M. Toward a Better Understanding of Human Eye Disease Insights From the Zebrafish, Danio Rerio. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 100, 287-330 (2011).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The Zebrafish As a Model for Cancer. Dis. Model. Mech. 3 (9-10), 9-10 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult Zebrafish As a Model Organism for Behavioural Genetics. BMC. Neurosci. 11, (2010).
- Mathur, P., Guo, S. Use of Zebrafish As a Model to Understand Mechanisms of Addiction and. Complex Neurobehavioral Phenotypes. Neurobiol. Dis. 40 (1), 66-72 (2010).
- Ignatius, M. S., Langenau, D. M. Zebrafish As a Model for Cancer Self-Renewal. Zebrafish. 6 (4), 377-387 (2009).
- Milan, D. J., MacRae, C. A. Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia. Prog. Biophys. Mol. Biol. 98 (2-3), 2-3 (2008).
- Van Trump, W. J., Coombs, S., Duncan, K., McHenry, M. J. Gentamicin Is Ototoxic to All Hair Cells in the Fish Lateral Line System. Hear. Res. 261 (1-2), 1-2 (2010).
- Littleton, R. M., Hove, J. R. Zebrafish: a Nontraditional Model of Traditional Medicine. J. Ethnopharmacol. 145 (3), 677-685 (2013).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line). PLoS One. 7 (5), 36661-36 (2012).
- Liang, J., Wang, D., Renaud, G., Wolfsberg, T. G., Wilson, A. F., Burgess, S. M. The Stat3/Socs3a Pathway Is a Key Regulator of Hair Cell Regeneration in Zebrafish [Corrected. J. Neurosci. 32 (31), 10662-10673 (2012).
- Nakae, M., Asaoka, R., Wada, H., Sasaki, K. Fluorescent Dye Staining of Neuromasts in Live Fishes: An Aid to Systematic Studies. Ichthyol Res. , 286-290 (2012).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent Probes That Stain Living Nerve Terminals. The J. Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Owens, K. N., Coffin, A. B., Hong, L. S., Bennett, K. O., Rubel, E. W., Raible, D. W. Response of Mechanosensory Hair Cells of the Zebrafish Lateral Line to Aminoglycosides Reveals Distinct Cell Death Pathways. Hear. Res. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Namdaran, P., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Identification of Modulators of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral. 32 (10), 3516-3528 (2012).
- Herrera, A. A., Banner, L. R. The Use and Effects of Vital Fluorescent Dyes: Observation of Motor Nerve Terminals and Satellite Cells in Living Frog Muscles. J. Neurocytol. 19 (1), 67-83 (1990).
- Hickey, P. C., Jacobson, D., Read, N. D., Louise Glass, ., L, N. Live-Cell Imaging of Vegetative Hyphal Fusion in Neurospora Crassa. Fungal. Genet. Biol. 37 (1), 109-119 (2002).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb Regeneration Is Impaired in an Adult Zebrafish Model of Diabetes Mellitus. Wound Repair Regen. 18 (5), 532-542 (2010).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).
