アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ
Summary
神経学的および非神経疾患の多くのゼブラフィッシュモデルは成魚ではなく、胚/幼虫で研究されているため、我々は大人のゼブラフィッシュの疾患モデルに適用することができ、定量的側線再生アッセイを開発しました。アッセイは、1）感丘および2）個々の有毛細胞レベルでの解像度を含んだ。
Abstract
原因人間に聴覚や平衡障害の臨床的重要性、そのようなゼブラフィッシュなどのモデル生物は側線の開発と再生を研究するために使用されてきた。ゼブラフィッシュは、その急速な開発時間と高い再生能力のような研究のために特に魅力的である。現在までに、側線再生のゼブラフィッシュの研究では、主な理由は、これらの段階でneuromasts数の減少の胚および幼虫期の魚を利用してきた。これは横方向のラインの再生/および以前の発達段階での容易な開発の定量分析を行いました。神経学的および非神経疾患の多くのゼブラフィッシュモデルは成魚ではなく、胚/幼虫で研究されているため、アッセイが利用可能になるように、我々はそれが現在にも適用することができる大人のゼブラフィッシュでは、定量的側線回生アッセイの開発に焦点を当て大人のゼブラフィッシュ疾患モデル。ヴァンスペクトラムによるこれまでの研究を踏まえP ら 17アダルトメキシコブラインド洞窟魚やゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）内有毛細胞の切除のための手順を説明した、私たちのアッセイは、対照群と実験群間の定量的な比較を可能にするために設計されました。これは、横方向のラインの定義された領域内の有毛細胞のゲンタマイシン誘発性壊死を次の24時間の期間にわたって感丘再現の割合（％）に基づいて、回生感丘標準曲線を開発することによって達成された。アッセイはまた、解像度の高いレベルが必要とされる個々の有毛細胞レベルの分析の拡張を可能にするように設計された。
Introduction
側線（LL）システムは、聴覚、バランス、走流性や、学校教育や捕食の回避1-5として仲介行動する責任があり、両方の魚や両生類に見られる機械刺激器官である。これは、支持細胞によって取り囲ま有毛細胞のクラスターで構成され、両方ともがneuromasts 6と呼ばれる構造に配置されている。これらneuromastsは、一般的に魚の頭の中で観察されたいくつかの横のステッチと身体と尾の長軸に沿って垂直線（ステッチと呼ばれる）に編成されています。成人では、neuromastsは、胚や仔魚6と比較して、ステッチ内の数値が有意に大きい。ゼブラフィッシュにおける生物医学の研究では、抗生物質治療、ノイズによる外傷、慢性感染症などの影響に焦点を当てている。より良い人間にその効果を理解するための試みで、有毛細胞に7,8。
ほとんどの脊椎動物とは異なり、TEこのようなゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）などleostsは、失われた有毛細胞を再生する能力を持っている。ゼブラフィッシュは、それらの迅速な開発時間と高い再生能力が特に有用である。今日まで、しかし;側線の開発および/ または再生にゼブラフィッシュの研究では、主に簡単にカウントおよび分析6,9,10を可能にし、横のラインneuromasts数の減少に胚および幼虫期の魚を利用している。
しかし、神経学的および非神経疾患11-16のような多くのゼブラフィッシュモデルは成魚としない幼虫で研究されて、我々はゲンタマイシンを使用して大人のゼブラフィッシュの横のラインに回生アッセイ（以前にゼブラフィッシュ幼生で使用されるアミノ配糖体の開発に焦点を当て、さらに最近では成魚17で使用される）ように、アッセイは、現在の大 人のゼブラフィッシュの疾患モデルに適用することができるよう利用可能であった。ヴァントランプeだけしばらく以前に公開された手順Tら17は、成魚での有毛細胞の切除のための条件を確立し、それらはコントロールとそのようなトランスジェニックゼブラフィッシュ系統または薬理学的に誘発される疾患状態を使用している場合などの実験グループ間の定量的な比較のために必要とされる感丘再生のための標準曲線を確立できませんでしたゼブラフィッシュ18。したがって、我々は、対照群と実験群を比較した場合、そのような大人のゼブラフィッシュ疾患モデルと同じように我々のデータを使用するために研究者を可能にするため感丘再生の標準曲線を確立するために、有毛細胞の切除のためのヴァントランプら 17の手順に従ったが、自分の仕事上に構築された。アッセイはまた、解像度の高いレベルが要求される場合、個々の有毛細胞への分析の拡張を可能にするように設計された。
Protocol
Representative Results
Discussion
胚および幼虫ゼブラフィッシュ8,24,25の横ライン（LL）再生の解析のために確立されている多くの文献に基づいて、我々の研究の目的は、ゼブラフィッシュの横のライン再生のための定量的アッセイを開発することだったことでし最高の成魚で研究された疾患モデルに適用される。私たちは、成魚に胚/仔魚のために開発された手順を適用するときに、ある臨界点が重要であることがわ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gentamicin sulfate solution (50mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| in methanol | |||
| 6 well plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| Image J software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System. | Any aquatic system can be used |
References
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