En analyse for Lateral Linje Regeneration i voksen sebrafisk

Summary

Fordi mange sebrafisk modeller av nevrologiske og ikke-nevrologiske sykdommer er studert i voksen fisk snarere enn embryo / larver, har vi utviklet en kvantitativ lateral linje regenerativ assay som kan brukes til voksne sebrafisk sykdomsmodeller. Analysen involvert oppløsning på 1) neuromast og 2) individuelle hår cellenivå.

Abstract

På grunn av den kliniske betydningen av hørsel og balanse lidelser i mennesket, har modellorganismer som sebrafisk blitt brukt til å studere lateral linje utvikling og fornyelse. Sebrafisk er spesielt attraktivt for slike studier på grunn av sin raske utvikling tid og høy evne til reproduksjon. Hittil har sebrafisk studier av sidelinje regenerering hovedsak benyttes fisk av embryonale og larvestadiet på grunn av lavere antall neuromasts på disse stadiene. Dette har gjort kvantitativ analyse av lateral linje regenerering og / eller utvikling lettere i de tidligere utviklingsstadier. Fordi mange sebrafisk modeller av nevrologiske og ikke-nevrologiske sykdommer er studert i voksen fisk og ikke i embryoet / larver, fokuserte vi på å utvikle en kvantitativ sidelinje regenerativ analysen i voksen sebrafisk, slik at en analyse var tilgjengelig som kan brukes på strøm voksen sebrafisk sykdom modeller. Bygger på tidligere studier av Van Trump et al. ¹⁷ som beskrevet prosedyrer for ablasjon av hårcellene i voksen meksikanske blind hulefisk og sebrafisk (Danio rerio), ble analysen vår utviklet for å tillate kvantitativ sammenligning mellom kontroll og eksperimentelle grupper. Dette ble oppnådd ved å utvikle en regenerativ neuromast standard kurve basert på prosenten av neuromast tilbakekomst over en 24 timers periode etter gentamicin-indusert nekrose av hår celler i et definert område av den laterale linje. Analysen ble også konstruert for å tillate forlengelse av analysen til den enkelte hår cellespenning når en høyere oppløsning er nødvendig.

Introduction

Sidelinjen (LL) system er en mechanosensory organ finnes i både fisk og amfibier som er ansvarlig for hørsel, balanse, rheotaxis og medier atferd som for eksempel skolegang og predator unngåelse ^1-5. Det er sammensatt av klynger av hårceller omgitt av støttelegemer, som begge er plassert i konstruksjoner kalles neuromasts ^6. Disse neuromasts er vanligvis ordnet i vertikale linjer (kalt masker) langs lengdeaksen av legemet og hale med noen små hull ble observert i hodet av fisken. I den voksne, neuromasts er betydelig større i antall i løpet av de masker som i forhold til embryonale eller larve fisk ^seks. Biomedisinske studier i sebrafisk har fokusert på effekten av antibiotikabehandling, støy-indusert trauma, kronisk infeksjon, etc. på hårcellene ^7,8 i et forsøk på å bedre forstå sine effekter hos mennesker.

I motsetning til de fleste virveldyr, teleosts, for eksempel sebrafisk (Danio rerio), har evnen til å regenerere tapte hårcellene. Sebrafisk er spesielt nyttige på grunn av deres raske utvikling tid og høy evne til reproduksjon. Til dags dato, men; sebrafisk studier på sidelinjen utvikling og / eller regenerering har hovedsakelig benyttet den embryonale og larvestadiet fisk på grunn av redusert antall lateral linje neuromasts som gjør det lettere å telle og analyse ^6,9,10.

Men er så mange sebrafisk modeller av nevrologiske og ikke-nevrologiske sykdommer ^11-16 studert i voksen fisk og ikke larvene, fokuserte vi på å utvikle en sidelinje regenerativ analysen i voksen sebrafisk ved hjelp av gentamicin (et aminoglykosid tidligere brukt i sebrafisk larver og Mer nylig brukt sammen med voksen fisk ^17), slik at en analyse var tilgjengelige som kunne anvendes på aktuelle voksne sebrafisk sykdomsmodeller. Mens tidligere utgitt prosedyrer ved Van Trump et al. ¹⁷ etablerte betingelsene for hårcelle ablasjon i voksen fisk, gjorde de ikke etablere en standardkurve for neuromast regenerering som er nødvendig for kvantitativ sammenligning mellom kontroll og eksperimentelle grupper som ved bruk av transgene sebrafisk linjer eller farmakologisk indusert sykdomstilstander i sebrafisk ^18. Vi har derfor fulgt prosedyrene for Van Trump et al. ¹⁷ for hårcelle ablasjon, men bygget på deres arbeid for å etablere en standardkurve for neuromast regenerering slik at etterforskerne å bruke våre data når man sammenligner kontroll og eksperimentelle grupper som med voksne sebrafisk sykdom modeller . Analysen ble også konstruert for å tillate forlengelse av analysen til den enkelte hår cellen når en høyere oppløsning er nødvendig.

Protocol

Alle prosedyrer er utført i henhold til retningslinjene som er beskrevet i "Principles of Laboratory Animal Care" (National Institutes of Health publikasjon ingen. 85-23, revidert 1985) og den godkjente Rosalind Franklin Institutional Animal Care og bruk komité dyr protokollen 08-19. En. Gentamicin-induksjon av Hair cellenekrose Forbered gentamicin sulfat i normal saltoppløsning ved en endelig konsentrasjon på 0,004% (4,32 mM). Plasser voksen fisk (D. r…

Representative Results

Optimalisering av prosedyrene for å kvantifisere neuromast regenerering av sidelinjen i voksen sebrafisk. De neuromasts av larvesebrafisk er lett kvantifiserbare; har imidlertid den laterale linje av den voksne sebrafisk et mye større antall neuromasts pr søm gjør kvantitative analyser vanskeligere 6,17,19,20. Som vist i figur 1A, har hodet en betydelig høyere antall neuromasts i forhold til enten den midtre del eller hale; med hale område s…

Discussion

Basert på den omfattende mengde litteratur som har blitt etablert for analyse av sidelinje (LL) regenerering i embryo-og larvesebrafisk ^8,24,25, målet med vår studie var å utvikle en kvantitativ analyse for sidelinje regenerering i sebrafisk som kunne påføres sykdom modeller som er best studert i voksen fisk. Vi fant ut at visse kritiske punkter er viktig når du søker prosedyrer utviklet for embryo / larve fisk til voksen fisk. Den viktigste av disse punkter betraktes: 1) antall laterale linje neuroma…

Materials

Gentamicin sulfate solution (50mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp)	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
in methanol
6 well plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System.		Any aquatic system can be used