En analyse for sidelinje Regeneration i Voksen Zebrafisk
Summary
Fordi mange zebrafisk modeller af neurologiske og ikke-neurologiske sygdomme er undersøgt i voksne fisk snarere end embryo / larver, har vi udviklet en kvantitativ sidelinje regenerativ assay, der kan anvendes til voksne zebrafisk sygdomsmodeller. Analysen involverede opløsning på 1) neuromast og 2) individuelle hår celle niveauer.
Abstract
På grund af den kliniske betydning af hørelse og balance lidelser hos mennesker, har modelorganismer såsom zebrafisk er blevet brugt til at studere lateral udvikling og regeneration linje. Zebrafisken er særligt attraktivt for sådanne undersøgelser på grund af sin hurtige tid udvikling og dens høje regenerationsevne. Til dato har zebrafisk studier af sidelinje regenerering anvendes hovedsageligt fisk af embryonale og larvestadier på grund af det lavere antal neuromasts på disse stadier. Dette har gjort kvantitativ analyse af sidelinje regenerering / og eller udvikling lettere i de tidligere udviklingsstadier. Fordi mange zebrafisk modeller af neurologiske og ikke-neurologiske sygdomme studeres i den voksne fisk og ikke i embryoet / larver, vi fokuseret på at udvikle en kvantitativ sidelinje regenerativ assay i voksen zebrafisk, således at en analyse var til rådighed, der kunne anvendes til løbende voksne zebrafisk sygdomsmodeller. Med udgangspunkt i tidligere undersøgelser af Van Trump m.fl. 17. der er beskrevet procedurer for ablation af hårceller i voksen mexicanske blind hule fisk og zebrafisk (Danio rerio), var vores analyse designet til at tillade kvantitativ sammenligning mellem kontrol og eksperimentelle grupper. Dette blev opnået ved at udvikle en regenerativ neuromast standardkurve baseret på procenten af neuromast genkomst over en 24 timers periode efter gentamicin-induceret nekrose af hårceller i et defineret område af den laterale linie. Assayet blev også designet til at tillade forlængelse af analysen til de enkelte hår celle niveau, når en højere grad af opløsning er påkrævet.
Introduction
Den laterale linie (LL) system er en mechanosensory orgel findes i både fisk og padder, der er ansvarlig for hørelse, balance, rheotaxis og medierende adfærd, såsom skolegang og rovdyr undgåelse 1-5. Det består af klynger af hårceller omgivet af støtte celler, som begge er placeret i strukturer, der kaldes neuromasts 6. Disse neuromasts er typisk organiseret i lodrette linier (kaldet masker) langs længdeaksen af kroppen og halen med nogle vandrette sting observeret i hovedet af fisken. I den voksne, neuromasts er betydeligt større i antal inden for de masker, som i forhold til embryonale eller fiskelarver 6. Biomedicinske studier i zebrafisk har fokuseret på effekten af antibiotisk behandling, støj-induceret traumer, kronisk infektion osv. på hårceller 7,8 i et forsøg på bedre at forstå deres effekter i mennesker.
I modsætning til de fleste hvirveldyr, teleosts såsom zebrafisk (Danio rerio), har evnen til at regenerere tabte hårceller. Zebrafisk er særligt nyttige på grund af deres hurtige udviklingstid og høj regenerationsevne. Til dato, men; zebrafisk undersøgelser af lateral udvikling og / eller regenerering linje har primært udnyttet den embryonale og larvestadiet fisk på grund af det reducerede antal sidelinje neuromasts der giver mulighed for lettere optælling og analyse 6,9,10.
Men som mange zebrafisk modeller af neurologiske og ikke-neurologiske sygdomme 11-16 undersøgt i den voksne fisk og ikke larverne, vi fokuseret på at udvikle en sidelinje regenerativ assay i voksen zebrafisk hjælp gentamicin (et aminoglykosid tidligere anvendt i zebrafisk larver og mere for nylig brugt med voksne fisk 17), således at en analyse var til rådighed, der kunne anvendes på nuværende voksne zebrafisk sygdomsmodeller. Mens tidligere offentliggjorte procedurer Van Trump et al. 17 fastsat betingelserne for hår celle ablation i den voksne fisk, de ikke etablere en standard kurve for neuromast regeneration, som er nødvendig for kvantitativ sammenligning mellem kontrol og eksperimentelle grupper såsom ved brug af transgene zebrafisk linjer eller farmakologisk inducerede sygdomstilstande i zebrafisk 18. Vi fulgte derfor procedurerne i Van Trump et al. 17 til hår celle ablation, men bygget på deres arbejde med at etablere en standard kurve neuromast regenerering at gøre det muligt for efterforskerne at bruge vores data, når man sammenligner kontrol og eksperimentelle grupper som med voksne zebrafisk sygdomsmodeller . Assayet blev også designet til at tillade forlængelse af analysen til de enkelte hår celle, når en højere grad af opløsning er påkrævet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Baseret på den omfattende litteratur, der er blevet etableret for analyse af sidelinje (LL) regenerering i embryonale og larve zebrafisk 8,24,25, målet for vores undersøgelse var at udvikle en kvantitativ analyse for sidelinje regenerering i zebrafisk, der kunne anvendes på sygdomsmodeller, der er bedst undersøgt i den voksne fisk. Vi fandt, at visse kritiske punkter er vigtige, når anvendelse af procedurer, der er udviklet til embryonale / fiskelarver til voksne fisk. Den vigtigste af disse punkter bet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gentamicin sulfate solution (50mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| in methanol | |||
| 6 well plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| Image J software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System. | Any aquatic system can be used |
References
- Dambly-Chaudire, C., Sapde, D., Soubiran, F., Decorde, K., Gompel, N., Ghysen, A. The Lateral Line of Zebrafish: a Model System for the Analysis of Morphogenesis and Neural Development in Vertebrates. Biol. Cell. 95 (9), 579-587 (2003).
- Montgomery, J., Carton, G., Voigt, R., Baker, C., Diebel, C. Sensory Processing of Water Currents by Fishes. Phil. Trans. Royal Soc. London B Biol. Sci. 355 (1401), 1325-1327 (2000).
- Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W., Whitfield, T. T. Ototoxin-Induced Cellular Damage in Neuromasts Disrupts Lateral Line Function in Larval Zebrafish. Hearing Res. 284 (1-2), 1-2 (2012).
- Engelmann, J., Hanke, W., Mogdans, J., Bleckmann, H. Hydrodynamic Stimuli and the Fish Lateral Line. Nature. 408 (6808), 51-52 (2000).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguch, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line. PloS One. 7 (5), e36661 (2012).
- Raible, D. W., Kruse, G. J. Organization of the Lateral Line System in Embryonic Zebrafish. J. Comp. Neurol. 421 (2), 189-198 (2000).
- Coffin, A. B., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Extracellular Divalent Cations Modulate Aminoglycoside-Induced Hair Cell Death in the Zebrafish Lateral. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Ma, E. Y., Rubel, E. W., Raible, D. W. Notch Signaling Regulates the Extent of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral Line). J. Neurosci. 28 (9), 2261-2273 (2008).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and Fins: Non-Mammalian Models for Hair Cell Regeneration. Brain Res. 1277, 12-23 (2009).
- Bibliowicz, J., Tittle, R. K., Gross, J. M. Toward a Better Understanding of Human Eye Disease Insights From the Zebrafish, Danio Rerio. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 100, 287-330 (2011).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The Zebrafish As a Model for Cancer. Dis. Model. Mech. 3 (9-10), 9-10 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult Zebrafish As a Model Organism for Behavioural Genetics. BMC. Neurosci. 11, (2010).
- Mathur, P., Guo, S. Use of Zebrafish As a Model to Understand Mechanisms of Addiction and. Complex Neurobehavioral Phenotypes. Neurobiol. Dis. 40 (1), 66-72 (2010).
- Ignatius, M. S., Langenau, D. M. Zebrafish As a Model for Cancer Self-Renewal. Zebrafish. 6 (4), 377-387 (2009).
- Milan, D. J., MacRae, C. A. Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia. Prog. Biophys. Mol. Biol. 98 (2-3), 2-3 (2008).
- Van Trump, W. J., Coombs, S., Duncan, K., McHenry, M. J. Gentamicin Is Ototoxic to All Hair Cells in the Fish Lateral Line System. Hear. Res. 261 (1-2), 1-2 (2010).
- Littleton, R. M., Hove, J. R. Zebrafish: a Nontraditional Model of Traditional Medicine. J. Ethnopharmacol. 145 (3), 677-685 (2013).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line). PLoS One. 7 (5), 36661-36 (2012).
- Liang, J., Wang, D., Renaud, G., Wolfsberg, T. G., Wilson, A. F., Burgess, S. M. The Stat3/Socs3a Pathway Is a Key Regulator of Hair Cell Regeneration in Zebrafish [Corrected. J. Neurosci. 32 (31), 10662-10673 (2012).
- Nakae, M., Asaoka, R., Wada, H., Sasaki, K. Fluorescent Dye Staining of Neuromasts in Live Fishes: An Aid to Systematic Studies. Ichthyol Res. , 286-290 (2012).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent Probes That Stain Living Nerve Terminals. The J. Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Owens, K. N., Coffin, A. B., Hong, L. S., Bennett, K. O., Rubel, E. W., Raible, D. W. Response of Mechanosensory Hair Cells of the Zebrafish Lateral Line to Aminoglycosides Reveals Distinct Cell Death Pathways. Hear. Res. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Namdaran, P., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Identification of Modulators of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral. 32 (10), 3516-3528 (2012).
- Herrera, A. A., Banner, L. R. The Use and Effects of Vital Fluorescent Dyes: Observation of Motor Nerve Terminals and Satellite Cells in Living Frog Muscles. J. Neurocytol. 19 (1), 67-83 (1990).
- Hickey, P. C., Jacobson, D., Read, N. D., Louise Glass, ., L, N. Live-Cell Imaging of Vegetative Hyphal Fusion in Neurospora Crassa. Fungal. Genet. Biol. 37 (1), 109-119 (2002).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb Regeneration Is Impaired in an Adult Zebrafish Model of Diabetes Mellitus. Wound Repair Regen. 18 (5), 532-542 (2010).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).
