تحديد جينات جديدة ترتبط مع الجينات في الإنتاج<em> الزائفة الزنجارية</em> استخدام ميني<em> himar1</em> مارينر الطفرات ينقول بوساطة
Summary
نحن هنا وصف بروتوكول باستخدام بحار بوساطة الطفرات ينقول مصغرة himar1 لتوليد مكتبة متحولة عالية الكثافة الإدراج إلى الشاشة، وعزل وتحديد الجينات رواية المنظمين في prototypic الزائفة الزنجارية سلالة PAO1.
Abstract
الزائفة الزنجارية هي سالبة الجرام، بكتيريا البيئية مع قدرات التمثيل الغذائي تنوعا. P. الزنجارية هو الممرض الانتهازية البكتيرية التي تنص على الالتهابات الرئوية المزمن في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF). الافراط في السكاريد المحفظة تسمى الجينات، والمعروف أيضا باسم mucoidy، ويشجع على تشكيل الأغشية الحيوية مخاطي التي هي أكثر مقاومة من خلايا العوالق للعلاج الكيميائي للمضادات الحيوية ودفاعات المضيف. بالإضافة إلى ذلك، التحويل من nonmucoid إلى النمط الظاهري مخاطي هو علامة السريرية لظهور عدوى مزمنة في CF. الإفراط الجينات التي كتبها P. الزنجارية هي عملية ماص للطاقة التي ضرائب ثقيلة على الطاقة الخلوية. لذلك، يتم تنظيم الجينات في إنتاج عالية P. الزنجارية. من أجل فهم أفضل تنظيم الجينات، وصفنا بروتوكول باستخدام مصغرة himar1 ينقول الطفرات لتحديد الجينات منظم الروايةق في سلالة PAO1 prototypic. يتكون هذا الإجراء من خطوتين أساسيتين. أولا، ونقل ينقول مصغرة himar1 (pFAC) من المضيف E. القولونية SM10/λpir إلى المتلقي P. الزنجارية PAO1 عبر اقتران متحدر من والدين لإنشاء مكتبة متحولة عالية الكثافة الإدراج، والتي تم اختيارها على لوحات الزائفة عزلة أجار تستكمل مع الجنتاميسين. ثانيا، نحن فحص وعزل مستعمرات مخاطية لرسم خريطة للموقع من خلال الإدراج العكسية PCR باستخدام بادئات الحمض النووي لافتا إلى الخارج من الكاسيت الجنتاميسين وتسلسل الحمض النووي. باستخدام هذا البروتوكول، حددنا اثنين من المنظمين رواية الجينات، mucE (PA4033) وkinB (PA5484)، في سلالة PAO1 مع البرية من نوع mucA ترميز عامل مكافحة سيغما MucA للسيد الجينات منظم ALGU (AlgT، σ 22) . يمكن تعديل هذا البروتوكول الطفرات الإنتاجية العالية لتحديد الجينات الأخرى ذات الصلة الفوعة تسبب تغيير في كولونيويورك التشكل.
Introduction
قدرة الانتهازية، الممرض سالبة الجرام الزائفة الزنجارية لتحفيزه على إنتاج الجينات هو أحد العوامل الرئيسية في قدرتها على إنشاء بيوفيلم. الافراط في الجينات هو النمط الظاهري غالبا ما يشار إليها باسم mucoidy. عزل مستعمرات مخاطية من sputa الأفراد المصابين بالتليف الكيسي (CF) يدل على وجود عدوى مزمنة، ويرتبط مباشرة مع الانخفاض العام في صحة المريض 1. حاليا، فمن المفهوم أن تنظيم وإنتاج الجينات في P. الزنجارية يحدث في المقام الأول على اثنين من operons. الأول هو الاوبرون السكروز الجينات، والذي يحتوي على 12 الجينات (algD – alg8 – alg44 – algK – الالم – algG – algX – algL – ALGI – algJ – algF – الطحالب) التي هي المسئولة عن تصنيع وتصدير البوليمر الجينات عبر والجبلة المحيطية إلى خارج الخلية environmeالإقليم الشمالي 2-5. والاوبرون الثاني هو مجموعة من الجينات التي تبدأ مع عامل سيغما بديل ALGU / T والمستمر مع mucA، mucB، وmucD. ALGU / T هو منظم إيجابية، في حين تصنف mucAB-D كما المنظمين السلبية لإنتاج الجينات 6-8. بالإضافة إلى ذلك، والمنظمين النسخي، مثل AlgB، AlgQ، الغر، وRpoN، وكذلك في مرحلة ما بعد النسخي وتعديل آخر متعدية عن طريق التحكم القمع مقيضة، والنشاط كيناز (KinB) والتحلل البروتيني intramembrane، وأيضا ثبت أن تشارك في الجينات تنظيم 9-14.
تم إنشاء ينقول ناقلات صغيرة himar1 المعروفة باسم pFAC أصلا في مختبر الدكتور Mekalanos 'في كلية هارفارد الطبية 15. يتكون البلازميد pFAC عنصر القابلة للنقل يحيط بها اثنان يكرر مقلوب من 27 نقطة أساس وكاسيت الجنتاميسين المقاومة في الوسط (aacC1: 534 بي بي)، جين ترميز hyperactإيف transposase مارينر 16، والجينات ترميز β-اكتاماز (بلوخ) (الشكل 1). تسلسل المعلومات عن العنصر القابلة للنقل من pFAC متاح في عدد انضمام بنك الجينات: DQ366300 13. في pFAC، هناك موقع استنساخ متعددة (MCS) وراء الجينات aacC1 والذي يستخدم لتحديد موقع الإدراج الكروموسومات باستخدام العكسية PCR. واحدة ميزة كبيرة مع استخدام ينقول مصغرة himar1 هو ليس هناك حاجة لعوامل المضيف محددة للتبديل (الطفرات). بالإضافة إلى ذلك، هناك وفرة عالية من TA المواقع الإدراج ثنائي النوكليوتيد جدت في جميع أنحاء الجينوم من P. الزنجارية. على سبيل المثال، TA المواقع ثنائي النوكليوتيد الإدراج يحدث و94404 100229 مرات في PAO1 (6264404 بت في الثانية، بنك الجينات عدد الانضمام NC_002516.2) وPA14 (6537648 بت في الثانية؛ رقم الوصول بنك الجينات NC_008463) الجينوم، على التوالي. بسبب وفرة من TA ثنائي النوكليوتيد في الجينوم، ميني himar1 </em> ينقول يمكن أن يسبب عالية الكثافة والطفرات العشوائية، والتي هي مناسبة خاصة لتحليل الجينات الفوعة والجينات التي تنظم للغاية. نظريا، يمكن للينقول مصغرة himar1 إدراجها في أي الجينات غير الضرورية داخل جينوم P. الزنجارية. وهذا يوفر مواقع الإدراج TA حوالي 18 في إطار القراءة المفتوح في الجينوم PAO1.
هنا، نحن تصف البروتوكول باستخدام مصغرة himar1 بوساطة الطفرات ينقول لتحديد المنظمين رواية mucoidy في P. الزنجارية. وبشكل أكثر تحديدا، ونحن مترافق biparentally متجه pFAC تحتوي على ينقول مصغرة himar1 من E. القولونية SM10/λpir في nonmucoid أنموذجية التغذي سلالة PAO1. بعد دمج ينقول في الجينوم، سلالة المتلقي هو مثقف على الزائفة عزلة أجار (PIA) التي تحتوي على التريكلوسان الذي يمنع نمو E. القولونية. وبالتالي، مكتبة من المسوخ من <em> P. يمكن اختيار الزنجارية من النمو على PIA وحة تستكمل مع الجنتاميسين وجود النمط الظاهري مخاطي. ملاحظة، صحيح سوف مقابل ومتحولة التكامل بوساطة ينقول يكون النمط الظاهري المقاومة والحساسة للكربنيسيلين الجنتاميسين. في هذه الدراسة، تم عزل ما يقرب من 80،000 من المسوخ الإدراج PAO1 من خلال أربعة الإقتران منفصلة. نحن بعد ذلك فرزها لعزلات مخاطي، وتحديد موقع من قبل الإدراج تقييد انزيم الهضم، وربط والعكسية PCR. أجرينا تحليل لطخة الجنوبية باستخدام المقاومة كاسيت الجنتاميسين كما تحقيقا لرؤية عدد من الإدراج في الجينوم. توصلنا إلى أن أكثر من 90٪ من المسوخ التي تم الحصول عليها في الاقتران باستخدام هذا البروتوكول لم يحصل إلا على نسخة واحدة من himar1 في الجينوم وعرض النمط الظاهري المقاومة والحساسة للكربنيسيلين الجنتاميسين. وقد تم تحديد ما مجموعه 32 عزلات مخاطي، تم تعيين 22 منهم إلى مواضع مختلفة من P. الزنجارية PAO1كروموسوم. هذا المعدل من الإدراج توفر تغطية كافية لتحديد العديد من المنظمين رواية من الإفراط الجينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
من المهم أن نلاحظ أن هذه الطريقة يمكن استخدامها في الأنواع الأخرى الزائفة مع هذه التعديلات: احتضان P. المتألقة وP. الكريهة عند 30 درجة مئوية، وP. الشتوتسرية في 42 درجة مئوية، P. stuzeri ينبغي مثقف على لوحات LB تستكمل مع 150 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين؛ على خط…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الوطنية للملاحة الجوية والفضاء إدارة ولاية فرجينيا الغربية الفضاء غرانت اتحاد (ناسا WVSGC)، ومؤسسة التليف الكيسي (CFF-YU11G0) والمعاهد الوطنية للصحة وP20RR016477 P20GM103434 لشبكة فكرة ولاية فرجينيا الغربية للتميز بحوث الطبية الحيوية. نشكر Vonya M. Eisinger للمساعدة التقنية مع هذا العمل.
Materials
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 mL Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
- Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
- Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
- Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).. J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
- Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
- Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
- Browne, P., Barret, M., O’Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
- Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
- Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
- Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
- Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
- Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).
