Summary

Identificatie van nieuwe genen geassocieerd met alginaat Productie in<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Het gebruik van mini-<em> Himar1</em> Mariner transposon-gemedieerde mutagenese

Published: March 10, 2014
doi:

Summary

Hier beschrijven we een protocol met behulp van de mini-himar1 mariner-transposon mutagenese voor het genereren van een hoge dichtheid insertiemutant bibliotheek scherm, isoleren en identificeren van nieuwe alginaat toezichthouders in de prototypische Pseudomonas aeruginosa stam PAO1.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa is een Gram-negatieve, milieu-bacterie met veelzijdige metabolische mogelijkheden. P. aeruginosa is een opportunistische bacteriële pathogenen die chronische longinfecties bij patiënten met cystische fibrose (CF) stelt. De overproductie van een capsulair polysaccharide genoemd alginaat, ook wel mucoidy, bevordert de vorming van slijmerige biofilms die resistenter dan plankton cellen antibiotische chemotherapie en het afweersysteem zijn. Bovendien, de conversie van de nonmucoid tot mucoïde fenotype is een klinische merker voor het ontstaan ​​van chronische infectie bij CF. Alginaat overproductie door P. aeruginosa is een endergonic proces dat zwaar belast cellulaire energie. Daarom wordt alginaat productie sterk gereguleerd in P. aeruginosa. Om beter te begrijpen alginaat regelgeving, een protocol beschrijven we het gebruik van de mini-himar1 transposon mutagenese voor de identificatie van nieuwe alginaat regulators in een prototype stam PAO1. De procedure bestaat uit twee fasen. Eerst hebben we overgedragen de mini-himar1 transposon (PFAC) van gastheer E. coli SM10/λpir in ontvangende P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugatie een hoge dichtheid insertiemutant bibliotheek, die werden geselecteerd op Pseudomonas isolatie agarplaten aangevuld met gentamycine maken. Ten tweede hebben we afgeschermd en geïsoleerd van de slijmerige kolonies op de plaats van inbrengen in kaart door middel van omgekeerde PCR met behulp van DNA-primers naar buiten wijzende uit de gentamycine cassette en DNA-sequencing. Met behulp van dit protocol, hebben we twee nieuwe alginaat regulatoren, MUCE (PA4033) en kinB (PA5484), in stam PAO1 met een wild-type muca codeert voor het anti-sigmafactor muca voor de master alginaat regulator AlgU geïdentificeerd (ALGT, σ 22) . Deze hoog-mutagenese protocol kan worden aangepast voor het identificeren van andere virulentie genen veroorzaken veranderingen in colony morfologie.

Introduction

Het vermogen van de opportunistische, Gram-negatieve pathogeen Pseudomonas aeruginosa te alginaat overproductie is een belangrijke factor in het vermogen om een biofilm stellen. De overproductie van alginaat is een fenotype vaak aangeduid als mucoidy. De isolatie van slijmerige kolonies van de sputa van personen die lijden aan cystische fibrosis (CF) is een indicatie van een chronische infectie, en is rechtstreeks verbonden met een algemene daling van de gezondheid van de patiënt 1. Momenteel wordt ervan uitgegaan dat de verordening en de productie van alginaat in P. aeruginosa treedt vooral op bij twee operons. De eerste is het alginaat biosynthetische operon, die 12 genen bevat (algDalg8alg44algKAlgealgGAlgxalgLAlgialgJalgFAlga) dat verantwoordelijk is voor de synthese en de uitvoer van het alginaat polymeer over zijn het periplasma aan het extracellulaire environment 2-5. De tweede operon is een cluster van genen te beginnen met de alternatieve sigma factor algU / T en verder met muca, mucB en mucD. AlgU / T is een positieve regulator, terwijl mucAB-D worden geclassificeerd als negatieve regulatoren van alginaat productie 6-8. Bovendien, transcriptiefactoren, zoals ALGB, AlgQ, ALGr en RpoN, alsmede post-transcriptionele en post-translationele modificatie van katabolische repressie controle kinaseactiviteit (KinB) en intramembrane proteolyse, zijn ook getoond betrokken te zijn bij alginaat regelgeving 9-14.

De mini-himar1 transposon vector bekend als PFAC werd oorspronkelijk opgericht in Dr Mekalanos 'laboratorium aan de Harvard Medical School 15. De PFAC plasmide bestaat uit een transposon geflankeerd door twee omgekeerde herhalingen van 27 bp en een weerstand tegen gentamycine cassette in het midden (aacC1: 534 bp), een gen coderend voor het hyperactive mariner transposase 16, en een gen dat codeert voor β-lactamase (bla) (figuur 1). Sequentie-informatie voor de transposon van PFAC is verkrijgbaar bij de GenBank: DQ366300 13. In PFAC er een meervoudige kloneringsplaats (MCS) dat de aacC1 gen dat wordt gebruikt voor de identificatie van chromosomale insertieplaats middels omgekeerde PCR. Een groot voordeel met behulp van de mini-himar1 transposon is geen specifieke gastheer factoren zijn nodig voor de omzetting (mutagenese). Daarnaast is er een grote dichtheid aan de TA dinucleotide insertieplaatsen gevonden in het genoom van P. aeruginosa. Bijvoorbeeld, TA dinucleotide insertieplaatsen optreedt 94.404 en 100.229 keer in de PAO1 (6.264.404 bps, GenBank NC_002516.2) en PA14 (6.537.648 bps; GenBank toegangsnummer NC_008463) genomen, respectievelijk. Vanwege de overvloed van TA dinucleotide in het genoom, mini-himar1 </em> Transposon kan hoge dichtheid en willekeurige mutagenese, die bijzonder geschikt voor de analyse van virulentie genen en genen die sterk gereguleerd veroorzaken. Theoretisch kan de mini-himar1 transposon te voegen in elke niet-essentieel gen in het genoom van P. aeruginosa. Dit levert ongeveer 18 TA insertieplaatsen per open reading frame in de PAO1 genoom.

Hier, een protocol beschrijven we het gebruik van mini-himar1-transposon mutagenese om nieuwe regulatoren van mucoidy in P. identificeren aeruginosa. Meer specifiek, we biparentally geconjugeerd de PFAC vector die een mini-himar1 transposon van E. coli SM10/λpir in de nonmucoid prototrofe stam PAO1. Nadat de transposon is geïntegreerd in het genoom, de ontvangende stam wordt gekweekt op Pseudomonas isolatie agar (PIA) die triclosan die de groei van E. remt coli. Zo een bibliotheek van mutanten van <em> P. aeruginosa kan de groei geselecteerd op PIA plaat aangevuld met gentamycine en de aanwezigheid van de mucoïde fenotype. Let op, een echte transposon-gemedieerde versus een integratie mutant zal een gentamycine resistent en carbenicilline-gevoelige fenotype hebben. In deze studie werden ongeveer 80.000 insertiemutanten van PAO1 geïsoleerd door middel van vier afzonderlijke vervoegingen. We vervolgens gescreend op mucoïde isolaten, en bepaalde de plaats van invoeging door restrictie-enzym digestie, ligatie en omgekeerde PCR. We voerden Southern blot analyse met behulp van weerstand tegen gentamycine cassette als een probe voor het aantal insertie per genoom bekijken. We hebben vastgesteld dat meer dan 90% van mutanten verkregen per conjugatie met dit protocol had slechts een enkele kopie van het himar1 in het genoom en de weergegeven gentamycine resistente en carbenicilline-gevoelige fenotype. Een totaal van 32 mucoïd isolaten werden geïdentificeerd, 22 van hen werden toegewezen aan verschillende loci van de P. aeruginosa PAO1chromosoom. Dit tarief van inbrengen biedt voldoende dekking om verschillende nieuwe regulatoren van alginaat overproductie identificeren.

Protocol

1. Voorbereiding van Bacteriestammen en biparental Vervoeging Inoculeren E. coli SM10/λpir/pFAC in 5 ml Luria Broth (LB), aangevuld met 15 ug / ml gentamycine en in een incubator schudden overnacht bij 37 ° C. Inoculeren P. aeruginosa stam PAO1 in 5 ml LB, en plaats in een incubator schudden gedurende de nacht bij 42 ° C. Meet OD 600 overnachtende culturen en meng gelijke hoeveelheden PAO1 en E. coli PFAC zodat het uiteindelijke volume van 1-1,4 ml….

Representative Results

Zoals weergegeven in figuur 1, de mini-transposon himar1 mariner vector, PFAC bevat twee 27 bp omgekeerde herhalingen met TA insertieplaatsen flankeren de aacC1 gentamycineresistentiegen cassette, met σ 70-afhankelijke promoter, en een meervoudige kloneringsplaats (MCS). Bovendien, de PFAC vector bevat genen die voor de zeer actieve himar1 transposase, β-lactamase (bla) en de tra overdracht operon. De TA insteekopeningen zorgen voor een efficiën…

Discussion

Het is belangrijk op te merken dat deze methode kan worden gebruikt in andere Pseudomonas species met deze aanpassingen: incuberen P. fluorescens en P. putida bij 30 ° C en P. stutzeri bij 42 ° C; P. stuzeri worden gekweekt op LB-platen gesupplementeerd met 150 ug / ml gentamycine, in stap 1.11, blz. stutzeri cellen worden overgebracht in 500 ui LB plaats van 1 ml. Daarnaast zijn er twee belangrijke stappen voor dit protocol. Ten eerste moet de ontvangende stam gek…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Aeronautics and Space Administration West Virginia Space Grant Consortium (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) en NIH P20RR016477 en P20GM103434 aan de West Virginia IDeA Network for Biomedical Research Excellence. Wij danken Vonya M. Eisinger voor de technische ondersteuning bij dit werk.

Materials

Luria Broth Difco 240230 via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar Difco 292710 via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm) Fisher Scientific 08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm) Fisher Scientific 08-757-14
Glycerol Fisher Scientific BP229-4
Benchtop Shaking Incubator New Brunswick Scientific Innova 4080 shake at 200 rpm
Cabinet Incubator VWR 1540
Benchtop Microcentrifuge Sorvall 75-003-287 via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops Fisher Scientific 22-363-597
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129
2.0 mL Cryogenic Vials Corning 430659 via Fisher Scientific
15 mL Tubes Fisher Scientific 05-539-12
Skim Milk Difco DF0032-17-3 via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)  Qiagen 69506 or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250) Qiagen 28106 or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)  Qiagen 27106 or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit Epicentre Technologies LK6201H via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath  Labnet NC0205808 via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease New England BioLabs R0138L
EasyStart Micro 50 Molecular BioProducts 6020 via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase New England BioLabs M0267L
iCycler, Thermocycler Bio-Rad 170-8740
LE agarose Genemate 3120-500 via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate Fisher Scientific BP918-1
2.0 mL Cryogenic Vials Corning 430659 via Fisher Scientific

References

  1. Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
  2. Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
  3. Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
  4. Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
  5. Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
  6. Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).. J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
  7. Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
  8. Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
  9. Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
  10. Browne, P., Barret, M., O’Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
  11. Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
  12. Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
  13. Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
  14. Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
  15. Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
  16. Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).

Play Video

Cite This Article
Withers, T. R., Yin, Y., Yu, H. D. Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis. J. Vis. Exp. (85), e51346, doi:10.3791/51346 (2014).

View Video