에 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자의 식별<em> 녹농균</em> 사용 미니<em> himar1</em> 마리너 트랜스포존 매개 돌연변이 유발
Summary
여기서 우리는, 화면 고밀도 삽입 돌연변이 체 라이브러리를 생성하기위한 미니 himar1 마리너 트랜스포존-매개 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명 분리 및 프로토 타입 녹농균 스트레인 PAO1 참신한 알긴산 레귤레이터를 식별한다.
Abstract
녹농균은 다양한 대사 기능이있는 그람 음성, 환경 세균이다. P. 녹농균은 낭포 성 섬유증 (CF) 환자에서 만성 폐 감염을 확립 기회 세균성 병원체이다. 또한 mucoidy로 알려진 알긴산이라는 캡슐 다당류의 생산 과잉은 항생제 화학 요법과 호스트 방어에 플랑크톤 세포보다 더 많은 저항 점액 바이오 필름의 형성을 촉진한다. 또한, 점액 표현형 nonmucoid의 변환은 CF 만성 감염의 발병에 대한 임상 마커입니다. P.에 의해 알긴산 과잉 생산 녹농균은 크게 세포 에너지를 세금을 에너지 흡수성 과정이다. 따라서, 알긴산 생산은 매우 P.에서 규제 녹농균. 더 알긴산 규제를 이해하기 위해, 우리는 신규 알긴산 레귤레이터의 식별을위한 미니 himar1 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명프로토 타입의 변형 PAO1에서의. 이 절차는 두 가지 기본 단계로 구성됩니다. 첫째, 우리는 호스트 E.에서 미니 himar1의 트랜스포존 (pFAC)을 전송 받는 사람 P.에 대장균 SM10/λpir 겐타 마이신으로 보충 슈도모나스 분리 아가 플레이트상에서 선택 하였다 고밀도 삽입 돌연변이 체 라이브러리를 생성하기 biparental 공액 통해 녹농균 PAO1. 둘째, 우리는 검사 및 겐타 마이신 카세트 및 DNA 염기 서열에서 바깥쪽으로 가리키는 DNA 프라이머를 사용하여 PCR 역을 통해 삽입 사이트를 매핑하는 점액 식민지입니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 (22 σ AlgT) 야생형 mucA 마스터 알긴산 레귤레이터에게도 누군가의 안티 – 시그마 인자 MucA을 인코딩 변형 PAO1 두 소설 알긴산 조절기, MUCE (PA4033) 및 kinB (PA5484)를 확인했습니다 . 이것은 높은 처리량 돌연변이 유발 프로토콜은 깔깔 변화를 일으키는 다른 병원성 관련 유전자의 식별을 위해 수정 될 수있다뉴욕의 형태.
Introduction
알긴산 염을 과잉 생산하는 기회, 그람 음성 병원균 녹농균의 능력은 생물막을 확립하는 기능의 주요 요인이다. 알긴산의 과잉 생산은 종종 mucoidy 언급 표현형이다. 낭포 성 섬유증 (CF)로 고통받는 개인의 가래에서 점액 콜로니의 절연은 만성 감염 나타낸다 직접 환자의 건강 하나의 전체적인 감소와 연관된다. 현재는 것이 이해된다 P.있는 알긴산의 규제 및 생산 녹농균은 주로 두 오페론에서 발생한다. 에서 알긴산 고분자의 합성 및 수출에 대한 책임이 있습니다 (조류 – alg8 – alg44 – algK – ALGE – algG – algX – algL – algI – algJ – – algF algD) 첫 번째는 12 유전자를 포함하는 알긴산 생합성 오페론이다 세포 environme에 페리 플라 즘NT 2-5. 두 번째 오페론은 대체 시그마 인자에게도 누군가 / T로 시작 mucA, mucB 및 MUCD 계속 유전자의 클러스터입니다. mucAB-D는 알긴산 생산 6-8의 부정적인 규제로 분류하는 동안 당신에게도 누군가 / T는, 긍정적 인 레귤레이터이다. 또한, 전사 등 ALGB, AlgQ, AlgR 및 RpoN 등의 규제뿐만 아니라, 전사 후 및 이화 억압 제어, 키나제 활성 (KinB) 및 intramembrane 단백질 분해에 의해 번역 후 변형은 또한 알긴산에 관여하는 것으로 밝혀졌다 규제 9-14.
pFAC로 알려진 미니 himar1의 트랜스포존 벡터는 원래 하버드 의과 대학 (15) 박사 Mekalanos '실험실에서 만들어졌습니다. pFAC 플라스미드는 두 개의 27 비트로의 반전 반복 중간에 겐타 마이신 저항 카세트 테이프 (aacC1 : 534 BP)에 의해 형벌 인자 (transposable element)로 구성되어, hyperact를 코딩하는 유전자선원 트랜스 포사 (16) 및 코딩하는 유전자 β-락타 마제 (BLA) (그림 1) 필자. DQ366300 13 : pFAC의 인자 (transposable element)의 시퀀스 정보는 GenBank 액 번호로 사용할 수 있습니다. pFAC에서, 역 PCR을 사용하여 염색체의 삽입 부위의 식별을 위해 사용된다 aacC1 유전자 뒤에 다중 클로닝 부위 (MCS)가있다. 미니 himar1의 트랜스포존을 사용하여 하나의 큰 장점은 특정 호스트 요인 트랜스 (돌연변이) 필요하지 않습니다이다. 또한, P.의 게놈에 걸쳐 발견 TA 디 뉴클레오티드 삽입 사이트의 높은 풍부가있다 녹농균. 각각의 게놈을, 예를 들어, TA 디 뉴클레오티드 삽입 사이트는 PAO1에 94404과 100229 번 발생 (6264404 BPS, GenBank 액 번호 NC_002516.2) 및 PA14 (GenBank 등록 액세스 번호 NC_008463 6537648 BPS). 때문에 게놈, 미니 himar1에서 TA 디 뉴클레오티드의 풍요 </em> 트랜스포존 독성 유전자의 분석 및 고도로 조절되는 유전자에 특히 적합하다 고밀도 및 무작위 돌연변이 유발을 일으킬 수있다. 이론적으로, 미니 himar1의 트랜스포존은 P.의 게놈 내에서 중요하지 않은 유전자에 삽입 할 수있는 녹농균. 이 PAO1 게놈의 오픈 리딩 프레임 당 약 18 TA 삽입 사이트를 제공합니다.
여기, 우리는 P.에 mucoidy의 새로운 규제를 식별하는 미니 himar1의 트랜스포존 매개 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명 녹농균. 보다 구체적으로, 우리 biparentally E.부터 미니 himar1 트랜스포존을 함유 pFAC 벡터를 접합 nonmucoid prototrophic 변형 PAO1에 대장균 SM10/λpir. 트랜스포존은 게놈에 통합 된 후, 수신자 균주는 슈도모나스 분리 한천 E.의 성장을 억제 (PIA) 덴타에 배양 대장균. 따라서,의 돌연변이 체 라이브러리 <em> P. 녹농균은 겐타 마이신 및 유 점액 표현형의 존재로 보충 PIA 접시에 성장에 의해 선택 될 수있다. 진정한 트랜스포존 매개 통합 돌연변이 대 겐타 마이신 내성 및 실린 민감한 표현형을해야합니다 유의하십시오. 본 연구에서는 PAO1 약 80,000 삽입 돌연변이 체는 네 개의 별도의 활용형을 분리 하였다. 우리는 그 점액 분리에 대한 검사를하고, 제한 효소 소화, 결찰 및 역 PCR에 의한 삽입의 위치를 결정. 우리는 게놈 당 삽입의 수를 볼 프로브로 겐타 마이신 저항 카세트를 사용하여 서던 블롯 분석을 수행 하였다. 우리는이 프로토콜을 사용하여 접합 당 얻은 돌연변이의 90 % 이상이 게놈에 himar1의 단 하나의 사본을 가지고 있었고, 겐타 마이신 내성 및 실린 민감한 표현형을 표시 것으로 판단. 32 점액 분리의 총이 확인되었으며, 그 중 22 P.의 다른 궤적에 매핑 된 녹농균 PAO1염색체. 삽입이 비율은 알긴산 과잉 생산의 몇 가지 새로운 규제를 식별하기 위해 적절한 범위를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
또한이 방법은 이러한 변경과 다른 슈도모나스 종에서 사용할 수 있음을주의하는 것이 중요하다 : P.보기 부화 의 fluorescens와 P. 30 ° C에서 푸티하고, P. 42 ° C에서 stutzeri, P. stuzeri은 겐타 마이신 150 ㎍ / mL의 보충 LB 플레이트에서 배양되어야한다 단계 1.11, P.에 stutzeri 세포는 LB 500 ㎕를 대신 1 ㎖로 전송해야한다. 또한이 프로토콜에 대한 두 가지 중요한 단계?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 바이오 메디컬 연구 우수 웨스트 버지니아 아이디어 네트워크에 미국 항공 우주국 웨스트 버지니아 공간 부여 컨소시엄 (NASA WVSGC), 낭포 성 섬유증 재단 (CFF-YU11G0)와 NIH P20RR016477 및 P20GM103434에 의해 지원되었다. 우리는이 작업과 기술 지원을 Vonya M. Eisinger 감사합니다.
Materials
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 mL Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
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