Identifisering av nye gener assosiert med Alginat Produksjonen i<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Ved hjelp av Mini-<em> Himar1</em> Mariner transposon-mediert Mutagenese

Summary

Her beskriver vi en protokoll ved hjelp av mini-himar1 mariner transposon-mediert mutagenese for å generere en høy tetthet innsetting mutant bibliotek til skjermen, isolere og identifisere nye alginat regulatorer i prototypic Pseudomonas aeruginosa belastning PAO1.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa er en gram-negativ, miljø-bakterie med allsidige metabolske funksjoner. P. aeruginosa er en opportunistisk bakteriell patogen som etablerer kroniske lungeinfeksjoner hos pasienter med cystisk fibrose (CF). Den overproduksjon av et kapsulært polysakkarid kalt alginat, også kjent som mukoiditet, fremmer dannelsen av slimaktig biofilmer som er mer motstandsdyktig enn planktoniske celler til antibiotikum kjemoterapi og vertens forsvar. I tillegg er konvertering fra ikke-mukoid til slimaktig fenotype en klinisk markør for utbruddet av kronisk infeksjon i CF. Alginat overproduksjon av P. aeruginosa er en endergonic prosess som tungt skatter cellulær energi. Derfor er alginat produksjon sterkt regulert i P. aeruginosa. For bedre å forstå alginat regulering, beskriver vi en protokoll ved hjelp av mini-himar1 transposon mutagenese for identifisering av romanen alginat regulators i en prototypic belastning PAO1. Fremgangsmåten består av to grunnleggende trinn. Først, vi overførte mini-himar1 transposon (pFAC) fra verts E. coli SM10/λpir til mottaker P. aeruginosa PAO1 via biparental konjugering å skape en høy tetthet innsetting mutant bibliotek, som ble valgt på Pseudomonas isolasjon agar plater supplert med gentamycin. Dernest, vi skjermet og isolert de slimaktig koloniene å kartlegge innstikkstedet gjennom invers PCR ved hjelp av DNA-primere som peker utover fra gentamycin kassett og DNA-sekvensering. Ved hjelp av denne protokollen, har vi identifisert to nye alginat regulatorer, mucE (PA4033) og kinB (PA5484), i belastning PAO1 med en villtype muca koding av anti-sigma faktor muca for master alginat regulator AlgU (AlgT, σ ²²⁾ . Denne high-throughput mutagenese Protokollen kan modifiseres for identifisering av andre virulens-relaterte gener som forårsaker endring i coloNY morfologi.

Introduction

Muligheten av opportunistiske, gram-negative patogene Pseudomonas aeruginosa for å overprodusere alginat er en viktig faktor i sin evne til å etablere en biofilm. Overproduksjon av alginat er en fenotype ofte referert til som mukoiditet. Isolasjon av slimaktig kolonier fra sputa av personer rammet av cystisk fibrose (CF) er et tegn på en kronisk infeksjon, og er direkte forbundet med en samlet nedgang i pasientens helse ^en. Foreløpig er det enighet om at regulering og produksjon av alginat i P. aeruginosa oppstår hovedsakelig på to operoner. Den første er den alginat biosyntetiske operon, som inneholder 12 gener (algD – alg8 – alg44 – algK – Alge – algG – algX – algL – ALGI – algJ – algF – alge) som er ansvarlig for syntese og eksport av alginat polymer tvers periplasma til ekstracellulære environment ^2-5. Den andre operon er en klynge av gener som begynner med den alternative sigma faktoren algU / T og fortsetter med muca, mucB, og mucD. AlgU / T er en positiv regulator, mens MucAB-D er klassifisert som negative regulatorer av alginat produksjon ^6-8. I tillegg transcriptional regulator, slik som AlgB, AlgQ, AlgR og RpoN, samt post-transkripsjonelle og post-translasjonell modifikasjon av catabolite undertrykkelse kontroll, kinaseaktivitet (KinB) og intramembrane proteolyse, har også vist seg å være involvert i alginat regulering ^9-14.

Den mini-himar1 transposon vektor kjent som pFAC ble opprinnelig opprettet i Dr. Mekalanos 'lab ved Harvard Medical School ^15. Den pFAC plasmidet består av et transportabelt element som flankert av to inverterte gjentagelser av 27 bp og en gentamycin motstand kassett i midten (aacC1: 534 bp), et gen som koder for hyperactive mariner transposase ^16, og et gen som koder for β-laktamase (bla) (figur 1). Sekvensinformasjon for den transposable element av pFAC er tilgjengelig på GenBank sjonsnummer: DQ366300 ^13. I pFAC, er det et multippel kloningssete (MCS) bak aacC1-genet som anvendes for identifisering av det kromosomale innføringsstedet ved hjelp av invers PCR. En stor fordel med å bruke mini-himar1 transposon er ingen spesifikke vertsfaktorer er nødvendig for innarbeiding (mutagenese). I tillegg er høy mengde av TA-dinukleotid innstikk finnes i hele genomet av P. aeruginosa. For eksempel, TA dinucleotide innstikk oppstår 94404 og 100229 ganger i PAO1 (6264404 bps, GenBank tiltredelse nummer NC_002516.2) og PA14 (6537648 bps, GenBank tilgang nummer NC_008463) genomer, henholdsvis. På grunn av overflod av TA dinucleotide i genomet, mini-himar1 </em> Transposon kan føre til høy tetthet og tilfeldig mutagenese, som er spesielt egnet for analyse av gener virulens og de gener som er sterkt regulert. Teoretisk kan det mini-himar1 transposon sette inn noen unødvendige gen innenfor genomet til P. aeruginosa. Dette gir ca 18 TA innstikk pr åpen leseramme i PAO1 genomet.

Her beskriver vi en protokoll ved hjelp av mini-himar1 transposon-mediert mutagenese å identifisere nye regulatorer av mukoiditet i P. aeruginosa. Mer spesifikt, vi biparentally konjugert den pFAC vektor som inneholder en mini-himar1 transposon fra E. coli SM10/λpir inn i ikke-mukoid proto belastning PAO1. Etter at transposon er integrert i genomet, er belastningen mottaker dyrket på Pseudomonas isolasjon agar (PIA) som inneholder triclosan som hemmer veksten av E. coli. Således, et bibliotek av mutanter av <em> P. aeruginosa kan velges av veksten på PIA plate supplert med gentamycin og tilstedeværelsen av slimaktig fenotype. Obs, en sann transposon-mediert vs en integrasjon mutant vil ha en gentamycin motstandsdyktig og Carbenicillin følsomme fenotype. I denne studien ble ca 80000 innsetting mutanter av PAO1 isolert gjennom fire separate bøyning. Vi deretter screenet for slimaktig isolater, og fast bestemt på stedet av innsetting av restriksjonsenzym fordøyelse, ligering og invers PCR. Vi utførte Southern blot-analyse ved bruk av gentamycin motstands kassetten som en probe for å se hvor mange innsettings per genom. Vi fastslått at mer enn 90% av mutanter innhentet per konjugering ved hjelp av denne protokollen hadde bare ett eksemplar av himar1 i genomet og vises den gentamycin motstandsdyktig og Carbenicillin følsomme fenotype. Totalt 32 slimaktig isolatene ble identifisert, 22 av dem ble kartlagt til forskjellige loci av P. aeruginosa PAO1kromosom. Denne prisen av innsetting gir tilstrekkelig dekning for å identifisere flere nye regulatorer av alginat overproduksjon.

Protocol

En. Utarbeidelse av bakteriestammer og Biparental Bøyning Vaksinere E. coli SM10/λpir/pFAC i 5 ml Luria-buljong (LB) supplert med 15 ug / ml gentamycin, og plasser i en ristende inkubator over natten ved 37 ° C. Vaksinere P. aeruginosa belastning PAO1 i 5 ml LB, og plasser i en risteinkubator over natten ved 42 ° C. Mål OD 600 overnattings kulturer og blande like mengder PAO1 og E. coli pFAC slik at det endelige volum er mellom 1 til 1,4 ml. …

Representative Results

Som illustrert i figur 1, er mini-himar1 mariner transposon vektor, pFAC, inneholder to 27 bp inverterte repetisjoner med TA innstikk flankerer aacC1 gentamycin motstand kassett, med sin σ 70-avhengige promotor, og en multippel kloningssete (MCS). I tillegg inneholder pFAC vektoren gener som koder for den høyaktiv himar1 transposase, β-laktamase (bla), og tra overførings operon. TA innstikk tillate en effektiv integrering i genomet av P. ae…

Discussion

Det er viktig å merke seg at denne metoden kan anvendes i andre Pseudomonas-arter med følgende forandringer: inkuber P. fluorescens og P. putida ved 30 ° C, og P. stutzeri ved 42 ° C; P. stuzeri skal dyrkes på LB-plater supplert med 150 pg / ml gentamycin, på trinnet 1.11, P. stutzeri cellene skal bli overført inn i 500 pl av LB i stedet for 1 ml. I tillegg er det to viktige skritt for denne protokollen. Først bør belastningen mottaker dyrkes ved passende te…

Materials

Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)	Fisher Scientific	08-757-14
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
Benchtop Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
Cabinet Incubator	VWR	1540
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 mL Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
15 mL Tubes	Fisher Scientific	05-539-12
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)	Qiagen	69506	or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase	New England BioLabs	M0267L
iCycler, Thermocycler	Bio-Rad	170-8740
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
2.0 mL Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific