Идентификация новых генов, ассоциированных с альгината производства в<em> Синегнойной палочки</em> Использование мини-<em> Himar1</em> Mariner транспозонов-опосредованного мутагенеза
Summary
Здесь мы опишем протокол, используя мини-himar1 моряка транспозонов-опосредованной мутагенеза для генерации вставки высокой плотности мутантный библиотеку для экрана, изолировать и идентифицировать новые регуляторы альгината в прототипического синегнойной палочки штамма PAO1.
Abstract
Синегнойная палочка является грамотрицательная, окружающей бактерию с универсальными метаболических возможностей. П. палочки является оппортунистической бактериальный патоген, который устанавливает хронические легочные инфекции у пациентов с кистозным фиброзом (CF). Перепроизводство в капсульного полисахарида под названием альгинат, также известный как mucoidy, способствует образованию слизистых биопленок, которые более устойчивы, чем планктонных клеток к химиотерапии антибиотиков и защитных сил организма. Кроме того, переход от nonmucoid к слизистой фенотипа является клиническим маркером наступления хронической инфекции в CF. Альгинат перепроизводство через Р. палочки является эндергонических процесс, который облагает большими налогами клеточной энергии. Таким образом, альгинат производство жестко регламентируется в P. палочки. Чтобы лучше понять, альгинат регулирование, мы опишем протокол с помощью мини-himar1 транспозонов мутагенеза для идентификации нового регулятора альгинатас в прототипического штамма PAO1. Процедура состоит из двух основных этапов. Во-первых, мы передали мини-himar1 транспозон (pFAC) от принимающей Е. палочка SM10/λpir в получателя P. палочки PAO1 через biparental сопряжения для создания вставки высокой плотности мутантный библиотеку, которые были отобраны на Pseudomonas изоляция пластин агара с добавлением гентамицина. Во-вторых, мы провели скрининг и изолировали слизистая колонии для отображения место введения посредством обратного ПЦР с использованием праймеров ДНК, указывающие наружу из кассеты гентамицина и секвенирования ДНК. Используя этот протокол, мы определили два новых регуляторов альгинат, mucE (PA4033) и kinB (PA5484), в штамм PAO1 с дикого типа Muca кодирующий фактор анти-сигма Muca для мастер-регулятора альгината AlgU (ALGT, σ 22) . Этот протокол мутагенеза высокой пропускной могут быть изменены для идентификации других генов вирулентности связанных вызывает изменения в колоNY морфология.
Introduction
Способность оппортунистической, грамотрицательных патогенов синегнойной палочки перепроизводства альгинат является основным фактором в его способности установить биопленку. Перепроизводство альгинат представляет собой фенотип часто называют mucoidy. Изоляция слизистых колоний от мокрота лиц, страдающих муковисцидозом (CF) свидетельствует о хронической инфекции, и непосредственно связана с общим снижением здоровья пациента 1. В настоящее время, следует понимать, что регулирование и производство альгината в P. палочки в первую очередь происходит в двух оперонов. Первым из них является альгинат биосинтеза оперона, который содержит 12 генов (algD – alg8 – alg44 – algK – ALGE – algG – algX – algL – Algi – algJ – algF – водоросль), которые отвечают за синтез и экспорта альгината полимера через периплазму с внеклеточным Environmeнт 2-5. Второй оперона является кластер генов начиная с альтернативной фактора сигма algU / T и продолжая Muca, mucB и mucD. AlgU / T является положительным регулятором, в то время как mucAB-D классифицируются как негативных регуляторов альгината производства 6-8. Кроме того, регуляторы транскрипции, такие как ALGB, AlgQ, AlgR и RpoN, а также пост-транскрипционного и пост-трансляционной модификации по катаболитной контроля репрессий, активности киназы (KinB) и внутримембранного протеолиза, также было показано, участвует в альгината регулирование 9-14.
Мини-himar1 транспозонов вектор известен как pFAC была создана в лаборатории доктора Mekalanos 'в Гарвардской медицинской школе 15. PFAC плазмида состоит из мобильных элементов между двух инвертированных повторов из 27 бит и гентамицина кассеты сопротивления в середине (aacC1: 534 п.н.), ген, кодирующий hyperactив моряка транспозазу 16 и ген, кодирующий β-лактамазы (бла) (рис. 1). Информация о последовательности для мобильных элементов из pFAC доступна на номер доступа GenBank: DQ366300 13. В pFAC, существует сайт множественного клонирования (MCS) за гена aacC1, который используется для идентификации месте установки хромосомной с помощью обратной ПЦР. Одно из главных преимуществ с помощью мини-himar1 транспозон никаких конкретных факторы хозяина не требуется для транспозиции (мутагенеза). Кроме того, существует высокая обилие динуклеотид сайтов вставки TA найденных во всем геноме P. палочки. Например, TA сайты встраивания динуклеотида происходит 94404 и 100229 раз в PAO1 (6264404 бит, GenBank номер доступа NC_002516.2) и PA14 (6537648 бит; номер доступа GenBank NC_008463) геномов, соответственно. Из-за обилия динуклеотида TA в геноме, мини-himar1 </em> Транспозона могут привести к высокой плотности и случайного мутагенеза, который является особенно подходящим для анализа генов вирулентности и генов, которые высоко регулируемых. Теоретически, мини-himar1 транспозона можно вставить в любой несущественным гена в геноме P. палочки. Это обеспечивает приблизительно 18 участков вставки TA на открытой рамки считывания в PAO1 генома.
Здесь мы опишем протокол с помощью мини-himar1 транспозонов-опосредованной мутагенеза для идентификации новых регуляторов mucoidy в P. палочки. В частности, мы biparentally конъюгировали вектор pFAC содержащий мини-himar1 транспозон от Е. палочка SM10/λpir в nonmucoid прототрофным штамма PAO1. После транспозона интегрирован в геном штамма получатель культивировали на агаре Pseudomonas изоляции (PIA), содержащих триклозан, который ингибирует рост E. палочка. Таким образом, библиотека мутантов <em> П. палочки могут быть выбраны по росту на PIA пластины с добавлением гентамицина и наличием слизистого фенотипа. Обратите внимание, что истинный транспозонов-опосредованной против интеграционного мутанта будет иметь фенотип, устойчивый и карбенициллина чувствительных гентамицин. В этом исследовании, около 80 тысяч вставки мутанты PAO1 были выделены через четыре отдельных сопряжений. Затем мы скрининг на слизистых изолятов, и определяется место вставки по ферментами рестрикции, лигирования и обратной ПЦР. Мы провели блот анализ с использованием гентамицина кассету сопротивления в качестве зонда, чтобы увидеть количество вставки на геном. Мы решили, что более 90% из полученных мутантов за сопряжения с помощью этого протокола было только одну копию himar1 в геноме и отображается на фенотип, устойчивый и карбенициллина чувствительных гентамицин. В общей сложности 32 мукоидных изолятов были определены, 22 из них были нанесены на карту к разным локусов P. палочки PAO1хромосома. Этот показатель вставки обеспечивает адекватного охвата определить несколько новых регуляторов альгината перепроизводства.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важно отметить, что этот метод может быть использован в других видов Pseudomonas с этими изменениями: инкубировать P. флуоресцирующей и П. putida при 30 ° С и P. stutzeri при 42 ° С; П. stuzeri должны быть культивированы на LB пластины с добавлением 150 мкг / мл гентамицина; на шаге 1,11, P. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным аэронавтике и исследованию космического пространства Западной Вирджинии космических грантов консорциума (НАСА WVSGC), Муковисцидоз Фонда (CFF-YU11G0) и NIH P20RR016477 и P20GM103434 к идее сети Западной Вирджинии для биомедицинских исследований передового опыта. Мы благодарим Vonya М. Айзингер за техническую помощь с этой работой.
Materials
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 mL Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
- Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
- Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
- Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).. J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
- Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
- Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
- Browne, P., Barret, M., O’Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
- Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
- Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
- Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
- Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
- Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).
