Identifiering av nya gener associerade med alginat Produktion i<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Med hjälp av Mini-<em> Himar1</em> Mariner Transposon mutagenes

Summary

Här beskriver vi ett protokoll med hjälp av mini-himar1 mariner transposon mutagenes för att generera en hög densitet insättning mutant bibliotek till skärmen, isolera och identifiera nya alginat tillsynsmyndigheter i prototypiska Pseudomonas aeruginosa stam PAO1.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa är en gramnegativ, miljö-bakterie med mångsidiga metaboliska kapacitet. P. aeruginosa är en opportunistisk bakteriell patogen som etablerar kroniska lunginfektioner hos patienter med cystisk fibros (CF). Överproduktionen av en kapsulär polysackarid kallas alginat, även känd som mucoidy, främjar bildningen av mukoida biofilmer som är mer motståndskraftiga än planktonceller till antibiotikum kemoterapi och värdförsvar. Dessutom är omvandlingen från nonmucoid till slemmig fenotyp en klinisk markör för uppkomsten av kronisk infektion i CF. Alginat överproduktion av P. aeruginosa är en endergonic process som starkt beskattar cellernas energi. Därför är alginat produktionen starkt reglerad i P. aeruginosa. För att bättre förstå alginat lagstiftning, beskriver vi ett protokoll med hjälp av mini-himar1 transposonmutagenes för identifiering av nya alginat regulatorar i en prototypisk stam PAO1. Förfarandet består av två grundläggande steg. Först överförde vi mini-himar1 transposon (pFAC) från värd E. coli SM10/λpir in mottagaren P. aeruginosa PAO1 via biparental konjugation för att skapa en hög densitet insättning mutant bibliotek, som valdes ut på Pseudomonas isolering agarplattor kompletterade med gentamycin. För det andra, vi avskärmade och isolerade de mukoida kolonierna att kartinsticksstället genom omvänd PCR med hjälp av DNA-primers som pekar utåt från gentamycin kassetten och DNA-sekvensering. Med användning av detta protokoll har vi identifierat två nya alginat regulatorer, mucE (PA4033) och kinB (PA5484), i stammen PAO1 med en vildtyp Muca kodar för anti-sigmafaktor Muca för master alginat regulator AlgU (AlgT, σ ²²⁾ . Denna high-throughput mutagenes protokoll kan modifieras för att identifiera andra virulens-relaterade gener som orsakar förändringar i colony morfologi.

Introduction

Förmågan hos den opportunistiska, gramnegativa patogenen Pseudomonas aeruginosa att överproducera alginat är en viktig faktor för dess förmåga att etablera en biofilm. Överproduktionen av alginat är en fenotyp ofta kallad mucoidy. Isoleringen av mukoida kolonier från sputa av individer som lider av cystisk fibros (CF) är ett tecken på en kronisk infektion, och är direkt förknippad med en allmän nedgång i patientens hälsa ^1. För närvarande är det underförstått att regleringen och produktion av alginat i P. aeruginosa sker främst på två operon. Den första är den alginat-biosyntetiska operonet, som innehåller 12 gener (algD – alg8 – alg44 – algK – alge – algG – algX – algL – ALGI – algJ – algF – alg) som är ansvarig för syntesen och export av alginatet Polymeren tvärs periplasman med den extracellulära environmennt ^2-5. Den andra operon är ett kluster av gener som börjar med alternativa sigmafaktorn algU / T och fortsätter med Muca, mucB och mucD. AlgU / T är en positiv regulator, medan mucAB-D klassificeras som negativa regulatorer av alginat produktion ^6-8. Dessutom transkriptionsregulatorer, såsom AlgB, AlgQ, AlgR och RpoN, samt post-transkriptionell och post-translationell modifiering av katabolitrepression kontroll, kinasaktivitet (KinB) och intramembrane proteolys har också visat sig vara inblandade i alginat reglering ^9-14.

Mini-himar1 transposonvektor kallas pFAC skapades ursprungligen i Dr Mekalanos lab vid Harvard Medical School ^15. Den pFAC plasmid består av ett transposabelt element som flankeras av två inverterade upprepningar om 27 bps och en gentamycin motstånd kassett i mitten (aacC1: 534 bp), en gen som kodar för hyperactive mariner-transposas ^16, och en gen som kodar för β-laktamas (bla) (Figur 1). Sekvensinformation för det transponerbara elementet i pFAC är tillgänglig vid GenBank accessionsnummer: DQ366300 ^13. I pFAC finns ett multipelt kloningsställe (MCS) bakom aacC1 genen som används för identifiering av insättningsstället kromosomala användning av omvänd PCR. En stor fördel med att använda mini himar1 transposon är inga specifika värdfaktorer krävs för införlivande (mutagenes). Dessutom finns det stor förekomst av TA dinukleotid insertionsställen som finns i hela genomet hos P. aeruginosa. Till exempel, TA dinukleotid insticksställen inträffar 94.404 och 100.229 gånger i PAO1 (6.264.404 bps, GenBank tillträdesnummer NC_002516.2) och PA14 (6.537.648 bps, GenBank åtkomstnummer NC_008463) genom, respektive. På grund av överflödet av TA dinukleotid i genomet, mini-himar1 </em> Transposon kan orsaka hög densitet och slumpmässig mutagenes, som är särskilt lämplig för analys av virulensgener och de gener som är mycket reglerade. Teoretiskt kan mini-himar1 transposon infoga i varje icke-essentiell gen i genomet av P. aeruginosa. Detta ger cirka 18 TA ingsplatser per öppen läsram i PAO1 genomet.

Här beskriver vi ett protokoll med användning av mini-himar1 transposon mutagenes för att identifiera nya regulatorer av mucoidy i P. aeruginosa. Mer specifikt vi biparentally konjugeras den pFAC vektor som innehåller en mini-himar1 transposon från E. coli SM10/λpir i nonmucoid prototrofa stammen PAO1. Efter transposonen integreras i genomet, är den mottagande stammen odlade på Pseudomonas Isolation Agar (PIA) som innehåller triklosan som hämmar tillväxten av E. coli. Sålunda kan ett bibliotek av mutanter av <em> S. aeruginosa kan selekteras genom tillväxt på PIA plattan kompletterat med gentamycin och närvaron av den mukoid fenotyp. Observera, en sann transposon-medierad kontra ett integrations mutant har en gentamycin resistent och carbenicillin känsliga fenotyp. I denna studie var cirka 80.000 inför mutanter av PAO1 isolerade genom fyra olika konjugationer. Vi screenas sedan för slemmig isolat, och bestäms platsen för införing av restriktionsenzymdigerering, ligering och invers PCR. Vi utförde Southern blot-analys med användning av gentamycin motstånd kassetten som en sond för att se hur många insättnings per genomet. Vi bestämde att mer än 90% av mutanter som erhållits per konjugering använder detta protokoll hade bara ett enda exemplar av himar1 i genomet och visade den gentamycin resistenta och carbenicillin känsliga fenotyp. Sammanlagt 32 slemmig isolat identifierades, 22 av dem var mappas till olika loci av P. aeruginosa PAO1kromosom. Denna andel insättning ger tillräcklig täckning för att identifiera flera nya regulatorer av alginat överproduktion.

Protocol

1. Beredning av bakteriestammar och Biparental konjugation Ympa E. coli SM10/λpir/pFAC i 5 ml Luria Broth (LB) supplementerad med 15 pg / ml gentamycin och placera det i en skakinkubator över natten vid 37 ° C. Inokulera P. aeruginosa stam PAO1 i 5 ml LB, och lägg i en skakande inkubator över natten vid 42 ° C. Mät OD 600 av natten kulturer och blanda lika delar PAO1 och E. coli pFAC så att den slutliga volymen är mellan 1 till 1,4 ml. <l…

Representative Results

Såsom illustreras i figur 1, den mini-himar1 mariner transposon vector, pFAC innehåller två 27 bp inverterade upprepningar med TA insättningsställen flankerar aacC1 gentamycin motstånd kassett, med dess σ 70-beroende promotorn och ett multipelt kloningsställe (MCS). Dessutom innehåller pFAC vektor gener som kodar för den högaktiva himar1 transposas, β-laktamas (bla) och tra överföring operonet. TA insättningsställen möjliggör en e…

Discussion

Det är viktigt att notera att denna metod kan användas i andra Pseudomonas-arter med dessa ändringar: inkubera P. fluorescens och P. putida vid 30 ° C, och P. stutzeri vid 42 ° C; P. stuzeri bör odlas på LB-plattor med tillsats av 150 | ig / ml gentamycin; på steg 1,11, P. stutzeri celler bör överföras till 500 l av LB istället för 1 ml. Dessutom finns det två viktiga steg för detta protokoll. För det första bör den mottagande stammen odlas vid den …

Materials

Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)	Fisher Scientific	08-757-14
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
Benchtop Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
Cabinet Incubator	VWR	1540
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 mL Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
15 mL Tubes	Fisher Scientific	05-539-12
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)	Qiagen	69506	or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase	New England BioLabs	M0267L
iCycler, Thermocycler	Bio-Rad	170-8740
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
2.0 mL Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific