Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Mit Mini-<em> Himar1</em> Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll, mit dem Mini-himar1 mariner Transposon-vermittelte Mutagenese zur Erzeugung einer hohen Dichte Insertionsmutante Bibliothek-Bildschirm, zu isolieren und zu identifizieren Roman Alginat-Regulatoren in der prototypischen Pseudomonas aeruginosa Stamm PAO1.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa ist ein Gram-negatives, Umwelt Bakterium mit vielfältigen Stoffwechselfunktionen. P. aeruginosa ist ein opportunistischer bakteriellen Krankheitserreger, der chronische Lungeninfektionen bei Patienten mit zystischer Fibrose (CF) herstellt. Die Überproduktion von Kapsel-Polysaccharid Alginat genannt, die auch als mucoidy bekannt, fördert die Bildung von schleimigen Biofilms, die resistenter als Planktonzellen antibiotische Chemotherapie und Wirtsabwehr sind. Außerdem ist die Umwandlung von der nonmucoid zu schleimige Phänotyp ein klinischer Marker für die Entstehung von chronischen Infektionen bei Mukoviszidose. Alginat Überproduktion von P. aeruginosa ist ein Prozess, der endergonische Zellenergie stark besteuert. Deshalb wird Alginat Produktion hoch in P. geregelt aeruginosa. Alginat Regulation besser verstehen, ein Protokoll unter Verwendung des Mini-himar1 Transposon-Mutagenese für die Identifizierung von neuen Alginat Regler beschreiben wirs in einer prototypischen Stamm PAO1. Das Verfahren besteht aus zwei Schritten. Zuerst vom Host E. übertragen wir die Mini-Transposon himar1 (PFAC) coli SM10/λpir in Empfänger P. aeruginosa PAO1 über biparental Konjugation an ein High-Density-Insertionsmutante-Bibliothek, die auf Pseudomonas Isolation Agar-Platten mit Gentamycin ergänzt ausgewählt wurden, erstellen. Zweitens, gesiebt und isoliert die schleimige Kolonien, um die Einstichstelle durch inverse PCR Karte mit DNA-Primer zeigt vom Gentamycinkassette und DNA-Sequenzierung nach außen wir. Über dieses Protokoll haben wir zwei neue Alginat-Regulatoren, mucE (PA4033) und Kinb (PA5484), in Stamm PAO1 mit einem Wildtyp-Muça Codieren der Anti-Sigma-Faktor Muça für die Master-Alginat Regler Algu (ALGT, σ 22) identifiziert . Dieses High-Throughput-Mutagenese-Protokoll kann für die Identifizierung von anderen Virulenz-Genen verursacht Änderung Colo modifiziert werdenny Morphologie.
Introduction
Die Fähigkeit des opportunistischen, Gram-negative Erreger Pseudomonas aeruginosa zu Alginat überproduzieren ist ein wichtiger Faktor in der Fähigkeit, einen Biofilm zu schaffen. Die Überproduktion von Alginat ein Phänotyp oft als mucoidy bezeichnet. Die Isolierung der schleimigen Kolonien von der Sputum von Patienten mit zystischer Fibrose (CF) betroffen ist, der eine chronische Infektion, und ist direkt mit einem generellen Rückgang in der Gesundheits 1 des Patienten verbunden. Gegenwärtig ist zu verstehen, daß die Regelung und die Produktion von Alginat in P. aeruginosa tritt vor allem bei zwei Operonen. Die erste ist die Alginat-Biosynthese-Operon, die 12 Gene enthält (ALGD – alg8 – alg44 – algK – ALGE – algG – algX – algL – ALGI – algJ – algF – Alge), die für die Synthese und den Export des Alginatpolymer über verantwortlich sind das Periplasma der extrazellulären environment 5.2. Die zweite Operon ist ein Cluster von Genen, beginnend mit dem alternativen Sigmafaktor Algu / T und Weiterbildung mit Muça, mucB und mucD. Algu / T ist ein positiver Regulator, während mucAB-D werden als negative Regulatoren der Alginat-Produktion 8.6 eingestuft. Zusätzlich Transkriptionsregulatoren, wie ALGB, AlgQ, ALGR und RpoN sowie post-Transkriptions-und post-translationale Modifikation von Katabolitrepression Kontrolle, Kinase-Aktivität (Kinb) und Intramembranproteolyse haben auch gezeigt, dass in Alginat einbezogen werden Regulierung 14.09.
Die Mini-himar1 Transposon-Vektor als PFAC bekannt wurde ursprünglich in Dr. Mekalanos 'Labor an der Harvard Medical School 15 erstellt. Die PFAC Plasmid besteht aus einem transponierbaren Element von zwei invertierten Wiederholungen von 27 bps und einem Gentamycin-Resistenzkassette in der Mitte (aacC1: 534 bp) flankiert, die ein Gen kodiert, hyperactive mariner Transposase 16, und ein Gen β-Lactamase (bla) (Abbildung 1). Sequenzinformationen für das Element des Transposons PFAC ist an der GenBank-Zugangsnummer zur Verfügung: DQ366300 13. In PFAC gibt es eine multiple Klonierungsstelle (MCS) hinter dem aacC1-Gen, das für die Identifizierung des chromosomalen Insertionsstelle mit inversen PCR verwendet. Ein großer Vorteil bei der Verwendung des Mini-himar1 Transposon keine spezifischen Wirtsfaktoren sind für die Umsetzung (Mutagenese) erforderlich. Darüber hinaus besteht eine hohe Häufigkeit der TA-Dinukleotid Insertionsstellen im gesamten Genom von P. gefunden aeruginosa. Zum Beispiel, TA-Dinukleotid Insertionsstellen auftritt 94.404 und 100.229 mal in der PAO1 (6.264.404 bps, GenBank-Zugangsnummer NC_002516.2) und PA14 (6.537.648 bps; GenBank Zugangsnummer NC_008463) Genome sind. Aufgrund der Fülle von TA-Dinukleotid im Genom, Mini himar1 </em> Transposon kann die hohe Dichte und zufällige Mutagenese, die besonders geeignet für die Analyse der Virulenz-Gene und die Gene, die stark reguliert ist, verursachen. Theoretisch kann die Mini-himar1 Transposons in jeder nicht-essentiellen Gens im Genom von P. einfügen aeruginosa. Dies bietet etwa 18 TA Insertionsstellen pro offene Leserahmen in der PAO1 Genom.
Hier ein Protokoll mit Mini-himar1 Transposon-vermittelte Mutagenese neue Regulatoren der mucoidy in P. identifizieren beschreiben wir aeruginosa. Genauer gesagt, wir biparentally konjugiert PFAC den Vektor, der ein Mini-Transposon aus E. himar1 coli SM10/λpir in die nonmucoid prototrophen Stamm PAO1. Nachdem das Transposon in das Genom integriert ist, ist die Empfängerstamm kultiviert auf Pseudomonas Isolation Agar (PIA), die Triclosan, die das Wachstum von E. hemmt coli. Somit wird eine Bibliothek von Mutanten <em> P. aeruginosa durch das Wachstum auf PIA Platte mit Gentamycin und die Anwesenheit des schleimigen ergänzt Phänotyp ausgewählt werden. Beachten Sie, dass eine wahre Transposon-vermittelte gegen eine Integration Mutante eine Gentamicin resistent und Carbenicillin-sensitiven Phänotyp haben. In dieser Studie wurden rund 80.000 Insertionsmutanten von PAO1 durch vier separaten Konjugationen isoliert. Wir dann gesiebt für schleimige Isolate und bestimmt die Stelle der Insertion mittels Restriktionsenzym-Verdau, Ligation und inverse PCR. Wir führten Southern-Blot-Analyse unter Verwendung des Gentamycin-Resistenz-Kassette als eine Sonde, die Anzahl der Einführungs pro Genom zu sehen. Wir haben festgestellt, dass mehr als 90% der Mutanten pro Konjugation mit diesem Protokoll erhalten hatte nur eine einzige Kopie des himar1 im Genom und angezeigt die Gentamicin resistent und Carbenicillin-sensitiven Phänotyp. Insgesamt 32 schleimige Isolate wurden identifiziert, von denen 22 wurden zu verschiedenen Loci des P. zugeordnet aeruginosa PAO1Chromosom. Diese Rate der Einführung bietet eine ausreichende Abdeckung zu mehreren neuartigen Regulatoren der Alginat-Überproduktion zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist wichtig zu beachten, dass diese Methode auch in anderen Pseudomonas-Arten mit diesen Änderungen verwendet werden: P. inkubieren fluorescens und P. putida bei 30 ° C und P. stutzeri bei 42 ° C; P. stuzeri sollte auf LB-Platten mit 150 ug / ml Gentamycin ergänzt kultiviert werden; Schritt auf 1.11 P. stutzeri Zellen sollten in 500 ul LB statt 1 ml übertragen. Zusätzlich gibt es zwei kritische Schritte für dieses Protokoll. Erstens sollte der Empf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Aeronautics and Space Administration West Virginia Raum Zuschuss Consortium (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) und NIH P20RR016477 und P20GM103434 an die West Virginia IDeA Netzwerk für Biomedical Research Excellence unterstützt. Wir danken Vonya M. Eisinger für die technische Unterstützung bei dieser Arbeit.
Materials
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 mL Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
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