Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics
Summary
Celoppervlakeiwitten biologisch belangrijke en sterk geglycosyleerd. We introduceren hier een glycopeptide-capture benadering oplosbaar te maken, te verrijken, en deglycosylate deze eiwitten voor facile LC-MS gebaseerde proteomics analyses.
Abstract
Celoppervlakeiwitten, waaronder extracellulaire matrixeiwitten, aan alle belangrijke cellulaire processen en functies, zoals groei, differentiatie en proliferatie. Een uitvoerige karakterisatie van deze eiwitten biedt rijke informatie voor de ontdekking van biomarkers, celtype-identificatie, en drug-target selectie, evenals het helpen om ons begrip van cellulaire biologie en fysiologie te bevorderen. Oppervlakte-eiwitten, echter, vormen belangrijke analytische uitdagingen, vanwege hun inherent lage overvloed, hoge hydrofobiciteit, en zware post-translationele modificaties. Profiterend van de heersende glycosylering op oppervlakte-eiwitten, introduceren we hier een high-throughput glycopeptideresistente capture benadering die de voordelen van een aantal bestaande N-glycoproteoomanalyses middelen integreert. Onze methode kan de glycopeptides afgeleid van oppervlakte-eiwitten te verrijken en te verwijderen van hun glycanen voor facile proteomics via LC-MS. De opgeloste N-glycoproteome omvat de informatie eiwit identiteit en kwantiteit als hun sites van glycosylering. Deze methode is toegepast op een reeks studies in gebieden zoals kanker, stamcellen en druggiftigheid. De beperking van de werkwijze ligt in de geringe hoeveelheden oppervlakte-membraaneiwitten, zodat een relatief grote hoeveelheid monsters is vereist voor deze analyse werden studies gericht op cytosolische eiwitten.
Introduction
Celoppervlakte-eiwitten interageren met de omgeving en relais signalen van buiten naar de binnenkant van een cel. Aldus zijn deze eiwitten, waaronder extracellulaire matrixeiwitten, spelen kritieke rollen in alle aspecten van cellulaire biologie en fysiologie variërend van proliferatie, groei, migratie, differentiatie veroudering enzovoort. Oppervlakte-eiwitten functioneren door interactie met andere cellen, eiwitten en kleine moleculen 1-3. Moleculaire karakterisering van cel-oppervlakte-eiwitten van groot belang, niet alleen voor biologen, maar ook voor farmaceutische bedrijven, aangezien meer dan 60% van geneesmiddelen gericht op het celoppervlak eiwitten 4.
Tandem massaspectrometrie (MS), met zijn superieure gevoeligheid, nauwkeurigheid en doorvoer voor de identificatie van eiwitten en peptiden, is een krachtig hulpmiddel voor globale proteomics studies 5,6. Toch, oppervlakte-eiwitten vormen belangrijke uitdagingen voor MS-gebaseerde proteomics, alsde meeste oppervlakte-eiwitten bestaan in kleine hoeveelheden en met zware modificaties. De membraanoverspannende gebieden van de oppervlakte-eiwitten hen hydrofoob te maken; dit is vooral het geval voor multipass transmembraaneiwitten. Het is dus moeilijk om membraaneiwitten in waterige oplossingen oplossen zonder de hulp van een detergens; echter het gebruik van reinigingsmiddelen onderdrukt het algemeen van de HPLC en MS 1,7,8 in proteïne-identificatie. Daarom membraaneiwitten zijn slecht gekenmerkt directe LC-MS gebaseerde proteomics.
Glycosylatie is een van de belangrijkste en meest voorkomende post-translationele modificaties die in cel-oppervlakte-eiwitten 9. De enorme complexiteit en de heterogeniteit van glycanen belemmeren peptiden 'MS signaal 10. Niettemin hebben verscheidene proteomics methoden deze unieke modificatie gebruikt om oppervlakte-eiwitten te verrijken en de suiker-resten van eiwitten voorafgaand aan LC-MS analyse te verwijderen. Deze methodes onder-lectine gebaseerde affiniteit capture 11 en-hydrazide gebaseerde of boorzuur gebaseerde chemische capture 12 evenals hydrofiele chromatografie scheidingen 8,13. De verwijdering van glycanen transformeert membraaneiwitten om regelmatig eiwitten en vereenvoudigt de MS karakterisering drastisch. Omdat glycosylering vindt ook plaats in uitgescheiden eiwitten die een hoge oplosbaarheid in tegenstelling tot eiwitten membraan, zijn veel glycoproteoomanalyse werkwijzen geoptimaliseerd voor oplosbare eiwitten en gewoonlijk minder glycopeptide selectiviteit en gevoeligheid wanneer ingezet eiwitten 8,14 membraan hebben. Andere methoden bestaan ook te verrijken met name cel-oppervlakte-eiwitten, zoals die met ultracentrifuge 15 en labeling strategieën 16. Een gedetailleerde vergelijking van onze werkwijze en andere bestaande methodes voor het karakteriseren membraaneiwitten werd uitgevoerd onlangs 17 en de resultaten gaven aan dat onze werkwijze evengoed presteren, zonietbeter dan alle vergeleken membraan proteomics methoden, maar met hogere eenvoud.
Om u te helpen onderzoekers gebruiken deze methode, we detail hier een algemeen protocol. Deze methode integreert verschillende voordelen van het bestaande glycoproteoomanalyses strategieën en is speciaal ontworpen voor membraanglycoproteïnen, maar de methode werkt net zo goed voor uitgescheiden eiwitten. De kenmerken van deze methode zijn: 1) een volledige solubilisering van membraaneiwitten, 2) een verrijking van glycopeptiden plaats van glycoproteïnen aan de potentiële sterische hindering te verwijderen bij gebruik van een vast substraat vastleggen, 3) het gebruik van hydrazide chemie covalente bindingen te vormen tussen glycopeptiden en vastleggen substraat, zodat de gebonden glycopeptiden stringente wasbehandelingen voor hoge glycoselectivity kan tolereren, en 4) de mogelijkheid om de gehele vastlegprocedure voeren in een buis voor verminderd monster en verkorte procedure duur. Na de implementatie van deze methode om het bestuderen van een varischappij van biologische monsters zoals cellen en weefsels, observeerden we een hoge selectiviteit (> 90%) aan glycoproteïnen 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier introduceren we een glycopeptide-capture strategie voor het profileren van cel-oppervlakte-eiwitten. De werkwijze kan worden toegepast voor uitgescheiden eiwitten, zoals in bloed, en in andere lichaamsvloeistoffen of celkweek media.
Het succes van de werkwijze berust op het volledige digestie van monsters; Daarom, een SDS-PAGE karakterisatie van de spijsvertering efficiëntie noodzakelijk, vooral voor de eerste keer analyse van een monster. Een volledige digestie kan een uitdaging voor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek is ondersteund door het opstarten fonds van Simon Fraser University.
Materials
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz Hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| Alpha-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
- Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
- Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function. The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).
- White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459, 344-346 (2009).
- Heijne, G. Membrane-protein topology. . Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).
- Lamond, A. I., et al. Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS). Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis. Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).
- Sun, B., et al. Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).
- Lowe, J. B. Glycosylation, immunity, and autoimmunity. Cell. 104, 809-812 (2001).
- Dodds, E. D. Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions. Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).
- Kaji, H., et al. Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins. Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).
- Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation. J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).
- Bond, M. R., Kohler, J. J. Chemical methods for glycoprotein discovery. Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).
- Pasini, E. M., et al. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells. Blood. 108, 791-801 (2006).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).
- Sun, B., et al. N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells. PLoS ONE. 8, (2013).
- Sun, B., et al. Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome. J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).
