Glycopeptides Capture pour protéomique de surface cellulaire
Summary
les protéines de surface cellulaire sont biologiquement importantes et largement glycosylée. Nous présentons ici une approche glycopeptides capture pour solubiliser, enrichir et deglycosylate ces protéines pour les analyses protéomiques faciles à base LC-MS.
Abstract
les protéines de surface cellulaire, y compris les protéines de la matrice extracellulaire, de participer à tous les processus et les fonctions cellulaires importantes, telles que la croissance, la différenciation et la prolifération. Une caractérisation complète de ces protéines fournit de l'information riche pour la découverte de biomarqueurs, l'identification du type de cellule, et la sélection cible thérapeutique, ainsi que d'aider à faire progresser notre compréhension de la biologie cellulaire et physiologie. protéines de surface, toutefois, posent des défis analytiques importantes, en raison de leur nature faible abondance, hydrophobie élevée, et des modifications post-traductionnelles lourds. Profitant de la glycosylation répandue sur les protéines de surface, nous présentons ici une approche glycopeptides capture à haut débit qui intègre les avantages de plusieurs moyens N-glycoprotéomique existants. Notre méthode peut enrichir les glycopeptides dérivés des protéines de surface et de retirer leurs glycanes pour la protéomique faciles à l'aide de LC-MS. La N-glycoproteome résolu comprend l'information de l'identité de la protéine et la quantité ainsi que de leurs sites de glycosylation. Cette méthode a été appliquée à une série d'études dans des domaines tels que le cancer, les cellules souches, et la toxicité des médicaments. La limitation de la méthode réside dans la faible abondance des protéines membranaires de surface, de telle sorte qu'une quantité relativement importante d'échantillons est nécessaire pour cette analyse par rapport à des études ont porté sur des protéines cytosoliques.
Introduction
les protéines de surface cellulaire interagissent avec l'environnement extracellulaire et transmettent des signaux à partir de l'extérieur vers l'intérieur d'une cellule. Ainsi, ces protéines, comprenant des protéines de la matrice extracellulaire, jouent un rôle essentiel dans tous les aspects de la biologie cellulaire et la physiologie allant de la prolifération, la croissance, la migration, la différenciation au vieillissement et ainsi de suite. les protéines de surface fonctionnent en interaction avec d'autres cellules, des protéines et des petites molécules 3.1. La caractérisation moléculaire des protéines de surface cellulaire est d'un grand intérêt non seulement pour les biologistes, mais aussi pour les sociétés pharmaceutiques, comme plus de 60% des médicaments sont destinées aux protéines de surface cellulaire 4.
Spectrométrie de masse en tandem (MS), avec sa sensibilité supérieure, la précision et débit pour l'identification des protéines et des peptides, a été un outil puissant pour les études protéomiques mondiaux 5,6. Pourtant, les protéines de surface posent des défis importants à la protéomique MS, commela plupart des protéines de surface existent en faibles quantités et avec des modifications lourdes. Les régions transmembranaires des protéines de surface rendent hydrophobe; ce qui est particulièrement le cas pour les protéines transmembranaires multipass. Il est donc difficile de dissoudre les protéines membranaires dans des solutions aqueuses, sans l'aide d'un détergent; toutefois, l'utilisation de détergents supprime généralement la performance de HPLC et MS 1,7,8 dans l'identification des protéines. Par conséquent, les protéines membranaires ont été mal caractérisé en protéomique basées directs LC-MS.
La glycosylation est l'une des modifications post-traductionnelles plus importantes et abondantes qui ont lieu dans les protéines de surface cellulaire 9. L'énorme complexité et l'hétérogénéité des glycanes entravent MS signal de peptides 10. Néanmoins, plusieurs procédés protéomiques ont utilisé cette modification unique pour enrichir les protéines de surface et d'éliminer les fragments de sucre à partir de protéines avant l'analyse LC-MS. Ces procédés comprennent basé lectine capture par affinité 11 et à base d'acide capture chimique ou borique base hydrazide-12 ainsi que des séparations chromatographiques hydrophiles 8,13. La suppression des glycanes transforme les protéines membranaires des protéines réguliers et radicalement simplifie la caractérisation MS. Parce que la glycosylation a également lieu dans les protéines sécrétées qui ont une forte solubilité contrairement aux protéines membranaires, de nombreuses méthodes glycoproteomic sont optimisés pour les protéines solubles, et ont tendance à avoir plus faible sélectivité des glycopeptides et sensibilité lorsqu'il est déployé aux protéines membranaires 8,14. D'autres procédés existent également à enrichir, en particulier, des protéines de surface cellulaire, tels que ceux utilisant une ultracentrifugation 15 et stratégies de marquage 16. Une comparaison détaillée entre notre méthode et d'autres méthodes existantes pour caractériser les protéines membranaires a été menée récemment 17, et les résultats ont indiqué que notre méthode peut effectuer aussi bien, si pasmieux, que toutes les méthodes de protéomique de la membrane par rapport, mais avec simplicité supérieur.
Pour aider les chercheurs utilisent cette méthode, nous détaillons ici un protocole général. Cette méthode intègre plusieurs avantages de stratégies de glycoprotéomique existantes et est conçu spécifiquement pour les glycoprotéines membranaires, encore la méthode fonctionne aussi bien pour des protéines sécrétées. Les caractéristiques de ce procédé comprennent: 1) une solubilisation complète de protéines membranaires, 2) l'enrichissement du glycopeptides au lieu de glycoprotéines pour éliminer l'encombrement stérique potentiel lors de l'utilisation d'un substrat solide de capture, 3) l'utilisation de la chimie de l'hydrazide pour former des liaisons covalentes entre glycopeptides et le substrat de capture, telles que des glycopeptides liés peuvent tolérer des lavages strictes pour haute glycoselectivity, et 4) la capacité d'effectuer la procédure de capture dans l'ensemble de tube pour une perte réduite de l'échantillon et de la durée de la procédure raccourcie. Après l'application de cette méthode à l'étude d'une variableciété d'échantillons biologiques, y compris les cellules et les tissus, nous avons observé une sélectivité élevée (> 90%) à des glycoprotéines 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous introduisons une stratégie glycopeptides capture pour le profilage des protéines de surface cellulaire. Le procédé peut être appliqué pour étudier les protéines sécrétées, tels que ceux dans le sang, ainsi que dans d'autres liquides corporels ou dans des milieux de culture cellulaire.
Le succès de la méthode repose sur la digestion complète d'échantillons; Par conséquent, une SDS-PAGE, la caractérisation de l'efficacité de la digestion est nécessaire,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage de l'Université Simon Fraser.
Materials
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz Hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| Alpha-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
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